2021/11/30
幹細胞エンジニアリングのための
モノクローナル細胞株の開発方法
モノクローナル抗体や細胞ベースの治療法などの治療薬を作製するための細胞株開発において、モノクロナリティの保証は紛れもなく重要です。細胞株を治療用に利用するためには、研究者はコロニー内の細胞がシングルセル細胞株由来であることを証明しなければいけません。シングルセルからのコロニー成長を追跡する明確な方法がなければ、単にプレーティングでコロニーを可視化したり、 モノクロナリティの確信度を用いたりしても、モノクロナリティの十分な証明にはなりません。では、モノクローナル細胞株を作製し、そのモノクロナリティを検証するために、他に何ができるでしょうか？
モレキュラーデバイスのCloneSelect® ソリューションは、モノクローナル細胞株開発のために大いに必要とされているワークフロー技術を提供します。我々は最近、アストラゼネカのバイオ医薬品開発部門の科学者であるGargi Royと、幹細胞株エンジニアリングを改善するための現在の課題と機会について議論しました。
以前、ロイと彼女の研究チームは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞から治療用モノクローナル抗体を作製するためにClonePix® FLを使用していました[1]。彼らが幹細胞エンジニアリングに焦点を移したとき、モノクローナル抗体産生という共通項にもかかわらず、2つのワークフローには違いがあることが明らかになりました。
アストラゼネカの幹細胞治療チームは、幹細胞エンジニアリングとモノクローナル開発に当社のCloneSelect製品を使用しています。さらに、Roy氏は、彼女のチームがモレキュラーデバイスのクローンスクリーニング・ソリューションの助けを借りて、より高い精度でモノクローナル細胞株を増殖させる方法について詳述しました。本記事では以下も取り上げています：
幹細胞エンジニアリングの概要
幹細胞エンジニアリングは、体細胞（精子細胞や卵細胞を除くあらゆる生物製剤細胞）や胚細胞を、あらゆる細胞種に分化する能力を持つ幹細胞に変えることを含みます。このアプローチは、疾患モデル、個別化医療、抗体探索、モノクローナル抗体のような幹細胞を用いた治療薬のための様々な細胞モデルを開発することを目的としています。
幹細胞エンジニアリングには、主に以下の2つのアプローチがあります：
- 人工多能性幹細胞（iPSC）： 人工多能性幹細胞（iPS細胞）：体細胞から転写因子を導入することで作製されます。
- 胚性幹細胞（ESC）： 未分化の胚内塊細胞から誘導されます。
どちらの幹細胞にも共通するのは、モノクローナル抗体の生産に活用できるということです。さらに、幹細胞を介したモノクローナル抗体は、組換えモノクローナル抗体よりも疾患部位への浸透性が高く、血液脳関門（BBB）通過率が高いなどの利点があります。[2].
CloneSelectシングルセルプリンターによる単細胞化
モノクローナル細胞株の作製とそれに続くモノクローナル性評価において、当社のCloneSelectワークフローソリューションが際立っているのはなぜでしょうか？ シングルセルをウェルに同時に注入し、ソート時にモノクロナリティを視覚的に証明できることを想像してみてください。
CloneSelect シングルセルプリンターシリーズは、シームレスなシングルセルの分離を保証し、他の細胞株とのクロスコンタミネーションの可能性を排除しながら、穏やかな細胞分置によりクローンのアウトグロースを最大限に促進します。その動作原理は、シングルセルを液滴に穏やかに封じ込め、ウェルに播種するマイクロ流体技術にあります。さらに、分注された細胞1個につき5枚の画像を取り込み、ソート時にシングルセル分注装置であることを画像ベースで証明します。
このように複雑なシステムでありながら、CloneSelectシングルセルプリンターは特許取得済みソフトウェアで簡単に操作できます。ラボで当社のフィールドアプリケーションサイエンティストチームによる簡単なトレーニングを受ければ、すぐにそのユーザーフレンドリーで細胞に優しい設計の恩恵を受けることができます。セル・フレンドリー」とは、以下の2点を指します：
- 高エネルギーのレーザーを使用しません（細胞へのやさしさは、穏やかな重力導入マイクロ流体工学によって達成されます）
- 分注量が少ないです（無駄がなく、サンプル間の汚染がありません）
おそらく最も重要なことは、CloneSelectシングルセルプリンターの高品質な細胞画像取得は、細胞の形状、サイズ、軸比に基づく排除基準に依存していることです。除外基準により、親細胞と所望の特性を持つエンジニアリング細胞の両方をクローニングすることができます。
モノクローナル細胞株の作り方： 一般的なワークフロー
iPS細胞、ESC細胞、その他多くの細胞種を扱うにしても、以下に要約するワークフローがモノクローナル細胞株作製の基本です：
- シングルセルのプリント：コロニーを形成するためにシングルセルを単離します。
- 細胞拡大および特性評価： コロニーを形成し、モノクロナリティを評価し、ジェノタイピング／フェノタイピングアッセイを実施することにより、細胞が目的のタンパク質を発現することを確認します。
- クローン細胞株： セルタイプ特異的分化
親細胞を含む任意の細胞集団から開始し、何かをクローン化したり、任意の特性を持つ細胞を作るためのエンジニアリングに使用するシンプルなワークフロー。
シングルセル分離とクローンアウトグロースにおける課題
最先端のシングルセル分離技術とモノクローナルワークフローを用いても、いくつかの課題にぶつかる可能性はあります。
Gargi Royによると、彼女のチームにとって主な課題は、複数のプレーティングに細胞をプリントし、同じ特徴を持つ複数のコロニーを形成したいときに生じました。シングルセル分離の再現性が高まるにつれて、クローンアウトグロースの効率は確実に低下します。アニマル・コンポーネント・フリー(ACF)条件を実施しようとすると、その低下はさらに鋭くなります。
クローンアウトグロース効率の差は、iPSCよりもESCの方が顕著です。エンジニアリングESCでは、効率が一桁台まで低下します。その主な理由は、プレーティング中の細胞生存能の低下、とRoy氏は述べています。彼女はまた、特にACF条件下で培地を濃縮することにより、実験デザインを改善することを強調しています。
IPSCとESCのシングルセルからのコロニーアウトグロース効率の差は、ESCにおける大きな相違を物語っています。
十分なクローンアウトグロースがあっても、アポトーシスを防ぐために細心の注意を払わなければいけません。8～10日のタイムリーな収穫が不可欠です。餓死を防ぐため、コロニーに毎日餌を与えることも有効でしょう。
細胞の凝集は、モノクロナリティ評価を妨げるもう一つの問題です。適切な解離試薬を使用し、ウェル表面から細胞を剥離する必要があります。
モノクローナル細胞株開発における保証の難しさ
細胞株開発において、モノクローナリティの検証は極めて重要です。規制当局への申請には、細胞集団がシングルセル由来であることを詳細に証明する必要があります。Roy氏の研究チームは、ESCは表面が粘着性で形状が不規則であるため、モニタリングが特に困難であることを発見しました。近接した2つのESCが注装置された場合、それらはシングルセルとして検出される可能性が高いです。また、締め切りが迫っている場合は、統計の限界希釈法を適用して、モノクロナリティの可能性を計算することもできます。
CloneSelect シングルセルプリンターは、シングルセルの単離の時点でモノクロナリティを証明する高度なイメージング技術を誇ります。このプリンターは、細胞成膜中に非常に近い2つの細胞を簡単に区別できるだけでなく、下の図に見られるように、コロニーを採取した日から0日目までさかのぼってモノクロナリティを保証することができます。
CloneSelectシングルセルプリンターによるモノクロナリティの確認とシングルセルイメージの取得
クローンの特性化
細胞株開発の最後の要素は特性化です。モノクロナリティが評価されたら、このモノクロナリティがジェノタイピングと多能性に反映されていることを確認します。コロニー内の細胞は全て、希望する機能性を一貫したレベルで持っているのでしょうか？ さらに重要なことは、コロニーがゲノム的に安定しているか、つまり遺伝物質を保存し、ある世代から次の世代へと受け継ぐことができるか、ということです。最後に、その細胞は多能性（すなわち、外胚葉、内胚葉、中胚葉という3つの主要な生殖層に分化できるか）なのでしょうか？ その答えは、ハイスループット・クローン・スクリーニングによってのみ得られます。
CloneSelect Imager は、モノクロナリティ保証のさらなる信頼性により、研究に付加価値を与えることができます。CloneSelect Imagerには、標識不要の明視野テクノロジーとカスタマイズ可能な蛍光イメージが搭載されており、コンフルエンス測定、成長曲線、モノクローナリティレポートの作成、各ウェルのコロニーのアウトグロースを素早く可視化するプレートサムネイルなどの高度なデータ解析ツールが付属しています。
高解像度と多彩なイメージングモードにより、クローン内の細胞に特異的な細胞マーカーを検出することもできます。これにより、モノクローナル細胞株が望ましい機能を有しているかどうかを確認することができます。
下の図は、モノクローナルESCが3つの異なる生殖細胞層に分化し、各層にそれぞれのバイオマーカーが存在することを示しています。
内胚葉、中胚葉、外胚葉の3つの生殖細胞層への分化を容易にします。
CloneSelect シングルセル・プリンターは、iPS細胞やESC細胞のシングルセル単離に効果的なツールです。CloneSelect Imager と CloneSelect プリンターを組み合わせることで、画像ベースで単細胞性を証明することができます。
- アストラゼネカ、バイオ医薬品開発部細胞培養・発酵科学博士、Gargi Roy氏
CloneSelect Imagerの機能評価範囲は、細胞分化段階を開始した後も継続します。蛍光イメージングにより、細胞が分化して異なる組織層を形成する様子をモニターすることができます。
モノクローナル細胞株についてもっと知りたいのですが？
最初のプレーティング段階からアウトグロース、細胞分化に至るまで、モノクローナル細胞株開発は、モノクロナリティ保証のための CloneSelect ワークフローを使用することでよりシンプルになります。
CloneSelect Single-Cell Printer および CloneSelect Imager のモノクロナリティ保証ワークフローの詳細については、アストラゼネカ幹細胞チームの研究をご覧ください。最近のモレキュラーデバイスのウェビナーでは、Gargi Royが、モノクローナル細胞株をエンジニアリングし、コロニー内の細胞を評価する方法を示す彼女の研究の詳細を用いて、モノクローナリティ保証における課題と解決策を説明しています。
- Roy, Gargi, et al. "Sequential screening by ClonePix FL and intracellular staining facilitate isolation of high producer cell lines for monoclonal antibody manufacturing." Journal of immunological methods 451 (2017): 100-110.Roy, Gargi, et al. "Sequential screening by ClonePix FL and intracellular staining facilitate isolation of high producer cell lines for monoclonal antibody manufacturing." Journal of immunological methods 451 (2017): 100-110.
- Frank, Richard T et al. “Concise review: stem cells as an emerging platform for antibody therapy of cancer.” Stem cells (Dayton, Ohio) vol. 28,11 (2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.Frank, Richard T et al. “Concise review: stem cells as an emerging platform for antibody therapy of cancer.” Stem cells (Dayton, Ohio) vol. 28,11 (2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.
