ウェスタンブロット

タンパク質の検出と定量に用いられる一般的な技術

ウエスタンブロッティングとは？

ウェスタンブロッティングは、タンパク質の検出と定量に用いられる一般的な技術です。細胞溶解液などの複雑な混合タンパク質から、目的の特異性タンパク質を分離・同定することができます。診断学、バイオテクノロジー、分子生物学、プロテオーム解析、その他多くの分野で応用されているウエスタンブロッティングは、細胞内のタンパク質発現レベル、サイズやその他の特性の変化を評価するために広く利用されています。

ウェスタンブロット法

ウェスタンブロットには、使用する二次抗体によっていくつかの方法があり、標的タンパク質の検出には比色分析、化学発光、蛍光などがあります。これらの方法について以下に説明するが、検出にはそれぞれ異なる装置が必要です。例えば、化学発光はX線フィルムやデジタルイメージング機器を用いて検出できますが、蛍光性の二次抗体には蛍光イメージャーが必要です。それぞれの検出法には利点と欠点があり、方法を選択する際に考慮する必要があります。

ScanLater™ウェスタンブロット検出システムは、マルチモードマイクロプレートリーダープラットフォームでウェスタンブロット検出が可能です。この基質フリーのアッセイを利用することで、研究者は従来の化学発光アッセイと同等の感度を達成しながら、ウエスタンブロット、ELISA、その他のアプリケーションを1台のリーダーに統合することができます。下記のアプリケーションノートに詳細が記載されています。

マイクロプレートリーダーでウェスタンブロット検出が可能なScanLater™ウェスタンブロット検出システム

ウエスタンブロッティングのワークフロー

以下に典型的なウェスタンブロットアッセイに使用される手順を示す：

1. 電気泳動を行う ー タンパク質はまずゲル電気泳動でサイズ別に分離されます。
2. 転写ー次に、通常ニトロセルロースまたはPVDFでできたブロッティングメンブレンに転写し、目的のタンパク質に特異的な一次抗体でプローブします。
3. ブロッキングバッファーでブロックする ー これは、一次抗体（次のステップ）がメンブレン自体に結合するのを防ぎます。
4. 一次抗体とインキュベートする 一 次抗体は標的タンパク質に結合します。
5. 洗浄バッファーで洗浄 ー 結合していない一次抗体を洗浄します。
6. 一次抗体を認識し結合する二次抗体を添加する ー この二次抗体は酵素やその他の物質と結合しており、ブロット上にバンドとして現れる目的のタンパク質を検出することができます。
7. 洗浄バッファーで洗浄 ー 結合していない二次抗体を洗浄します。
8. 選択した方法／化学物質を用いて検出する ー 標的タンパク質は、使用する二次抗体によって比色分析、蛍光法、発光法で検出することができます。