Application Note ウェルからウェスタンブロットへ
細胞性ヒートショック反応の研究

はじめに

細胞反応を調べるには、イメージング、細胞ベース の生存率や増殖アッセイ、タンパク質発現の変化を見るためのウェスタンブロットなど、情報を収集するための複数のアプローチが必要になることがあります。多くの場合、必要な結果を得るためには複数の設定プラットフォームが必要であり、その過程でいくつかのソフトウェア・パッケージを学ぶ必要があるかもしれません。

このアプリケーションノートでは、SpectraMax® i3 マルチモードプレートリーダーという1機器を用いて、関連する複数の細胞パラメーターのデータをどのように収集したかを示します。ヒートショックをモデルシステムとして使用し、イメージングやウェスタンブロットスキャンを含むさまざまな検出モードを使用して、多面的な細胞反応をどのように把握できるかを示しました。

細胞を通常より高い温度にさらすと、アポトーシス経路が活性化され、ヒートショックタンパク質HSP70の発現が増加することが知られています。健常またはストレス下の2つの異なる増殖条件下のCHO-K1細胞をヒートショックに暴露し、SpectraMax i3システムのイメージング機能を用いて増殖、生存能、アポトーシスを測定。ScanLater™ウェスタンブロット検出システムを用いて、ヒートショックに反応して発現が上昇するHSP70の発現を解析しました。

• CHO-K1細胞（ATCC）
• 細胞培養培地（10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン／ストレプトマイシン含有Ham's F12）
• 黒壁透明底組織培養マイクロプレート（Corning）
• SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax MiniMax™ 300 イメージングサイトメーター（モレキュラーデバイス）
• EarlyTox Cell Integrity Kit（モレキュラーデバイス）
• CellEvent Caspase-3/7 Green 検出試薬（Life Technologies)
• ScanLaterウエスタンブロット検出システム（モレキュラーデバイス）
• ScanLater：ユーロピウム標識ヤギ抗マウス抗体付き抗マウス評価キット（モレキュラーデバイス）
• ScanLaterウェスタンブロット検出カートリッジ（モレキュラーデバイス）
• 抗HSP70マウスモノクローナル抗体（R&D Systems）
• Immobilon-FL Membrane, 0.45 μm pore size (EMD Millipore)

方法

CHO-K1細胞は、健常細胞とストレス細胞の2種類を用意。健常細胞は培地を定期的に交換し、コンフルエンス80%以下で継代しました。一方、ストレス細胞はオーバーコンフルエントにさせ、培地交換の頻度を少なくしました。

ヒートショックの前日、イメージングと細胞ベースアッセイ用に、健常細胞またはストレス細胞を黒壁透明底96ウェル組織培養マイクロプレートに1ウェルあたり7500細胞で播種。ウェスタンブロットサンプルには、細胞を6ウェル組織培養プレートに1ウェル当たり225,000細胞で播種しました。

プレーティングの翌日、セルプレートの半分を45℃、90分間のヒートショックにかけました。ヒートショック直後、細胞をSpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターの透過光（TL）チャンネルでイメージングし、形態の変化を調べました。ヒートショック後6時間と24時間に、細胞を再度撮像して増殖を測定し、形態を再検査。StainFree™ Technologyを用いて、各ウェル内の個々の細胞を色素なしでカウントしました。

アポトーシスと細胞生存能の細胞ベースアッセイを行い、ヒートショックがアポトーシスやその他の細胞死経路を誘導したかどうか、またその反応が健常細胞とストレス細胞集団で異なるかどうかを調べました。CellEventアッセイを用いて、コントロールおよびヒートショック条件下でアポトーシス細胞を定量。モレキュラーデバイス EarlyTox™ Cell Integrity Assay Kitは、生細胞と死細胞の区別と計数に使用されました。両アッセイとも、ヒートショック期間の6時間後と24時間後に実施。

ウェスタンブロットでは、6ウェルプレートで培養・処理した細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、0.5% Tweenとプロテアーゼ阻害剤を加えたPBSで洗浄・溶解。細胞溶解液を遠心分離し、上清のタンパク質含量を測定しました。2.1μgの細胞抽出物を4-20%ゲルにロードし、PVDF膜に転写し、マウス抗HSP70、次いでユーロピウム標識抗マウス二次抗体でプローブしました。タンパク質バンドは、ScanLaterウェスタンブロット検出カートリッジ付きSpectraMax i3リーダーを用いて検出、定量しました。

細胞増殖

ヒートショック後、細胞はイメージングや他のアッセイに先立ち、6時間または24時間回復させました。この2つの時点で、SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターでStainFree細胞計数を用いて細胞数の差を定量化。このソフトウェアによる細胞の同定と計数には色素は必要なかったです。細胞の同定には、SoftMax® Proソフトウェアの事前設定が用いられました。ヒートショックを受けた細胞、特にストレスを受けた集団で増殖の減少が観察され、それは24時間後に顕著になりました（図1）。

アポトーシスアッセイ

6時間と24時間の時点で、細胞をアポトーシスについてアッセイしました。ヒートショック後6時間までに、ストレスを受けた細胞はアポトーシス細胞の割合が高かったが、24時間までには、ストレスを受け、ヒートショックを受けた集団の中に、より多くのアポトーシス細胞が見られました（図2）。対照的に、非ヒートショック細胞はアポトーシス細胞の割合が低く、安定していました。

細胞生存率アッセイ

細胞がアポトーシス以外の方法で死滅しているかどうかを調べるために、EarlyTox Cell Integrity Kitが用いられました。ヒートショックにより、特に24時間後に細胞死の増加が観察されました。ストレスを受けた細胞は、正常集団よりも死細胞の割合が全体的に高かったです。これらの結果はアポトーシスの結果とよく一致しており、観察された細胞死のすべて、あるいはほとんどがアポトーシスによるものであることを示唆しています。

HSP70誘導

ScanLaterウェスタンブロット解析の結果、予想通りHSP70はヒートショックに応答して誘導されましたが、この反応はストレス細胞よりも正常細胞集団の方がはるかに大きかったです。SoftMax® ProソフトウェアのScanLater解析により、ブロット上のバンドの強度が定量されました。ヒートショック6時間後の健常細胞ではHSP70が48倍増加しましたが、ストレス細胞では1.5倍しか増加しなかったです（図4）。非ヒートショック対照細胞で発現したHSP70の量は、ストレス細胞集団では正常細胞の約18倍でした。

結論

SpectraMax i3 マルチモードプレートリーダーを用いて、細胞ベースイメージングアッセイとウェスタンブロット検出を行い、ヒートショックに対する細胞反応を調べました。StainFree cell countingでは、正常細胞およびストレス細胞におけるヒートショックによる増殖の変化を同定。アポトーシスと細胞生存率アッセイにより、ヒートショックによる細胞死のメカニズムが明らかになりました。最後に、ウエスタンブロット分析により、コントロール細胞とヒートショック細胞におけるHSP70の誘導を定量することができました。アポトーシスと細胞生存能アッセイの結果から、私達は、ヒートショックに反応して起こる細胞死のすべて、あるいはほとんどがアポトーシスによるものと仮定。HSP70の誘導は、ヒートショック条件下では正常（非ストレス）細胞で最も高かったです。HSP70はヒートショック前にもストレス細胞で誘導され、ヒートショック下ではさらに誘導されました。しかし、ストレスを受けた細胞のHSP70は、健常細胞で誘導される高レベルには達しなかったです。その結果、ストレス細胞はアポトーシスからあまり保護されず、観察されたアポトーシス細胞の割合が高くなったのかもしれません。

SpectraMax i3システムとSoftMax Proソフトウェアによる解析により、従来は複数の検出装置と複数の異なるデータ解析ツールが必要でした細胞機能の多面的な調査が、単一のプラットフォームで実行できるようになりました。

SpectraMax i3xについてさらに詳しく >>