Application Note Spectral Fusion搭載SpectraMax i3xで高感度測定を実現
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多くのマイクロプレートリーダーや分光光度計は、蛍光および発光シグナルを検出するために光電子増倍管（PMT）を使用しています。PMTは、サンプルから特定の波長で放出された光子を検出し、それを電子に変換します。その後、電子増倍器によって信号が増幅され、相対蛍光単位（RFU）または相対発光単位（RLU）として検出・表示されます。
このテクニカルノートでは、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーに搭載された独自の特許技術であるSpectral Fusion™イルミネーションとAutoPMT™機能に焦点を当てます。本稿では、光学部品と電子部品の組み合わせによりデータを正規化し、最適な感度を提供するだけでなく、シグナルレンジを最大化する方法を説明します。
PMTはどのように動作するのか？
PMTは、光電陰極に入射する光子をカウントし、それを電子に変換します。まず電子は一次ダイノードに衝突し、その後一連のダイノードで増幅されます（図1）。生成される電子の数は、入射光子の数に比例しますが、PMTに適用される電圧またはゲインにも依存します。低いPMTゲインでは、1つの光子に対して生成される電子は、高いPMTゲインの場合よりも少なくなります。
図1. 光電子増倍管（PMT）の概略図。PMTは光子を電子に変換し、信号を増幅します。
材料と方法
フルオレセイン溶液はPBS中で初期濃度100μMで調製し、その後3倍希釈ステップで標準曲線を作成しました。標準曲線は100μMから0.01nMまでの14濃度で構成しました。
Alexa Fluor 430色素溶液はPBS中で初期濃度10μMで調製し、その後3倍希釈ステップで標準曲線を作成しました。標準曲線は10μMから0.1nMまでの10濃度で構成しました。
両蛍光色素について、200μLの溶液をソリッドブラック96ウェルマイクロプレートのウェルに3連で分注し、PBSをプレートブランクとして使用しました。プレートはSpectraMax i3xプレートリーダーで、以下の設定（表1）に従って測定しました。シグナルは取得後、SoftMax Proソフトウェアで解析しました。
| Fluorophore | Wavelength | PMT Gain settings |
|---|---|---|
| Fluorescein |
Read mode: Fluorescence Read type: Endpoint Excitation: 485 nm Emission: 535 nm Optimization: Z height |
Fixed at High (default) |
| Alexa Fluor 430 |
Read mode: Fluorescence Read type: Endpoint Excitation: 425 or 430 nm Emission: 540 nm Optimization: Z height |
At 425 nm: AutoPMT At 430 nm: Fixed at High (default) |
表1. フルオレセインおよびAlexa Fluor 430実験で使用した装置設定。
注：フルオレセイン（485nm）およびAlexa Fluor 430（425nm）の励起にはフラッシュランプを使用し、430nm励起にはLEDを使用します。
Spectral Fusionイルミネーション技術
SpectraMax i3xプレートリーダーは、Spectral Fusion™イルミネーションと呼ばれる特許取得済み光源を使用しています。この技術は、キセノンフラッシュランプとLEDを組み合わせて、装置のスペクトル範囲をカバーします（図2）。キセノンフラッシュランプは紫外域（250nm～429nm）および近赤外域（681nm～850nm）のサンプル励起に使用され、LEDは可視域（430nm～680nm）をカバーします。装置はソフトウェアで指定された波長に応じて光源を自動選択します。キセノンフラッシュランプを使用する場合、励起光は一定に保たれ、PMTゲインを調整して各サンプルの発光を測定します。この場合、SpectraMax i3xプレートリーダーは、サポートアプリケーションノート「SpectraMax iDおよびMシリーズマルチモードプレートリーダーにおけるAutoPMT™機能によるダイナミックレンジ拡張」で説明されているように、フラッシュランプベースのマイクロプレートリーダーとして動作します。PMTゲインは、マニュアル、高、中、低、または自動に設定できます（図3A）。AutoPMT設定は、データ品質を損なうことなくダイナミックレンジを拡張できるため、利用可能な場合は選択することを推奨します。
図2 Spectral Fusion™イルミネーション技術は、キセノンフラッシュランプ（250–429nmおよび681–850nm）とLED（430–680nm）を強力に組み合わせることで、スペクトル全体にわたり比類のないシグナル強度と優れた感度を提供します。
励起波長が430nmから680nmの範囲にある場合（図2参照）、LEDがカバーする範囲であるため、プレートリーダーは自動的にLED励起を選択します。この場合、LED強度は調整され、PMTゲインは感度が最適となる範囲で固定されます（図3B）。各LEDには4つの離散的な強度レベルがあり（図4）、SpectraMax i3xプレートリーダーは測定に必要な最適なLED強度を決定するために各ウェルを事前に読み取ります。この事前読み取りでは、装置は4つのLED強度レベルでウェルを読み取り、最も低いレベルから開始します。最適なLEDレベルは、PMTを最適な線形カウント範囲で使用しながら、飽和せず最大のシグナルを得られるレベルです。その結果、プレートの各ウェルは、それぞれに最適化されたLED強度レベルで励起されます。
図3 SpectraMax i3xのPMT設定：（A）フラッシュランプ使用時に調整可能なPMTレベル。（B）LED使用時にはPMTゲインはユーザー選択不可（デフォルトで「High」が表示）。
図4 SpectraMax i3xでLEDを使用したデータ正規化の可視化。低濃度サンプルでは最高LED強度（100％）で励起し、より濃度の高いサンプルでは低いLEDパワーを使用します。最終的なRFU値は正規化され、使用したLED強度レベルに依存しません。なお、表示されている強度レベルは説明用です。
最終的なRFU値は自動的に正規化され、広範な濃度範囲で線形性を実現します。フルオレセインでは、単一のマイクロプレート測定で最大6.5ログの濃度範囲を達成できました（図5）。
図5 SpectraMax i3xプレートリーダーのLEDを使用したフルオレセイン標準曲線。
LEDとキセノンフラッシュランプの比較
SpectraMax i3xプレートリーダーでフラッシュランプとLEDを使用して生成されたデータを比較するため、Alexa Fluor 430色素を使用しました。プレートは425nmと430nmで励起され、それぞれキセノンフラッシュランプまたはLEDを使用しました。データはRFU値を手動で正規化せずに同じグラフにプロットしました（図6）。異なる光源で励起されたにもかかわらず、単一濃度で非常に類似したRFU値を示し、両曲線は密接に重なりました。これは、キセノンフラッシュランプとLED間で信号が追加正規化され、選択された光源に依存せずデータを比較できるためです。この正規化により、装置はキセノンフラッシュランプとLED間をシームレスに切り替えながら、装置の全範囲で波長スキャンを実行できます。
図6 SpectraMax i3xプレートリーダーでフラッシュランプ（Ex 425nm、青）またはLED（Ex 430nm、緑）を使用して生成されたAlexa Fluor 430標準曲線。LEDでは、追加の希釈（1濃度ログ）を検出できました。
さらに、LEDはキセノンフラッシュランプよりも強力な光源であるため、より多くの光がサンプルに到達し励起します。そのため、LEDを使用できる場合は、キセノンフラッシュランプよりもダイナミックレンジと低濃度でのデータ再現性を向上できます。Alexa Fluor 430標準曲線（図6）では、LED（Ex 430nm）を使用することで、追加の希釈（1濃度ログ）を検出し、低濃度での変動（%CV）が小さくなりました。LED範囲の境界付近の励起波長を持つアッセイでは、LEDに対応する励起波長を選択することで明確な利点があります。さらに、これらのアッセイで波長最適化ウィザードを実行することで、プレートリーダーが最適な励起/蛍光ペアを選択します（詳細はアプリケーションノート「SpectraMax Paradigm プラットフォームとTUNEテクノロジーによる蛍光タンパク質の最適波長スキャニング」を参照）。
LED光源の重要な利点は、シグナル強度が時間経過や条件によって変化するキネティックアッセイです。キセノンフラッシュランプを使用する装置では、キネティック測定中にPMTゲインを固定する必要があります。ゲインが高すぎる場合、PMTが飽和し、一部のキネティックポイントが測定されません。ゲインが低すぎる場合、感度が低下し、精度や正確性が損なわれます。SpectraMax i3xプレートリーダーでは、固定PMTゲインと可変LED強度により、すべての測定タイプ（キネティック測定を含む）で単一プレート測定において8～9ログのダイナミックレンジでシグナル検出が可能です。これにより、非常に低いシグナルと非常に高いシグナルを同一プレートで飽和やデータ品質の低下なく検出できます。
結論
アッセイ結果は、アッセイ設定条件、製造公差、ユーザーの経験不足など、さまざまな理由で日ごとや装置間でわずかに変動することが一般的です。SpectraMax® i3xプレートリーダーに搭載された特許技術Spectral Fusion™イルミネーションは、これらの要因を補正し、研究者が高品質で再現性のある蛍光データを繰り返し取得できるようにします。この独自設計により、データ品質を損なうことなく、拡張されたダイナミックレンジで完全な線形性を実現します。Spectral Fusion™は、SpectraMax i3xプレートリーダーで利用可能なすべての蛍光測定タイプ（エンドポイント、キネティック、ウェルスキャン、スペクトル）に対応しています。
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