Application Note SpectraMax ParadigmとTUNEで
蛍光タンパク質測定を最適化

はじめに

モレキュラーデバイス社のSpectraMax® Paradigmマルチモードマイクロプレートリーダーは、Tunable Wavelength（TUNE）検出カートリッジを搭載し、フィルターの高感度と波長スキャンの柔軟性を兼ね備えています。TUNE検出カートリッジは革新的なモノクロメーター設計を採用しており、研究者が広範な波長範囲でアッセイを容易に最適化できるようにします。励起波長は360 nmから790 nm、蛍光波長は400 nmから850 nmまで、1 nm刻みで設定できます。さらに、TUNEは時間分解蛍光および発光検出機能を備えており、アッセイの適用範囲を拡張します。

特許出願中のSpectral Optimization Wizardは、信号対背景比を自動計算し、スキャンした蛍光色素に対して最適な励起波長と蛍光波長を決定することでワークフローを簡略化します。ヒートマップはスキャンした波長ペアの信号対背景比を視覚的に表示し、ユーザーは自動的に最適化された波長でアッセイを測定できます。これにより、単にピーク波長を使用する場合と比較して、EGFP検出の感度が80倍向上します。

励起および蛍光スペクトルスキャン

2種類の緑色蛍光タンパク質（GFP）変異体に対して個別の励起および蛍光スペクトルスキャンを実施しました。組換え型野生型GFP（Clontech）と強化型GFP（EGFP、BioVision）は、TEバッファー（pH 8）で10 mg/mLに希釈しました。GFPサンプル（50 µL）は黒色384ウェルマイクロプレートに分注し、スペクトル特性を測定しました。参照用にバッファーのみを含むブランクウェルも含めました。

励起および蛍光スペクトルスキャンでは、積分時間を140 msに設定しました。励起スキャンでは、蛍光波長を530 nmに設定し、励起スペクトルを360～500 nmの範囲で2 nm刻みでスキャンしました。蛍光スキャンでは、励起波長を440 nmに設定し、蛍光スペクトルを470～600 nmの範囲で2 nm刻みでスキャンしました。EGFPの励起ピークは394 nmから482 nmにレッドシフトし、蛍光ピークはGFPで506 nm、EGFPで512 nmと類似していました（図1）。

Spectral Optimization Wizard

SoftMax® Pro 6ソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用して、GFPおよびEGFP検出の最適波長を決定しました。Spectral Optimization Wizardの選択画面を図2に示します。最適化を実行するための設定と波長範囲の例を図3に示します。

Spectral Optimization Wizardは励起と蛍光を同時にスキャンし、次の式を使用して各励起/蛍光波長ペアの信号対背景比を計算します：（Signal – Background）/ Background。結果はヒートマップで表示され、信号対背景比が最も高い励起/蛍光波長ペアはクロスヘアアイコンで強調表示されます。GFPおよびEGFPの結果を図4に示します。

GFP変異体の検出感度は、Wizardで最適化された波長を使用することで向上しました（表1参照）。励起と蛍光ピーク波長が112 nm離れているGFPでは、Wizard最適化波長を使用することで感度の向上はわずかでした。しかし、ピーク励起と蛍光波長が30 nmしか離れていないEGFPでは、Spectral Optimization Wizardで計算された最適波長を使用することで、感度が80倍以上向上しました。最適励起と蛍光波長は50 nm離れて設定されるため、散乱励起光による干渉が減少します。

結論

TUNE Spectral Optimization Wizardは、任意の蛍光色素に対して最適な波長ペアを自動的に特定することで、新しい蛍光色素の波長最適化に必要な時間を少なくとも50％短縮します。励起360～790 nm、蛍光400～850 nmの範囲をカバーするTUNEは、最も一般的に使用される蛍光色素をすべて検出できます。TUNEで最適化された波長は、ストークスシフトが狭い蛍光色素を使用するアッセイに最大の利点を提供し、EGFP検出では感度が80倍向上することが示されました。さらに、TUNEは蛍光強度測定に加えて、時間分解蛍光および発光検出モードを提供し、アッセイの多様性を拡張します。

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