Application Note Genetix ClonePix FLを用いた
ハイブリドーマのスクリーニング

方法と結果

半固形培地での細胞樹立（安定ハイブリドーマ株を使用）

目的：細胞を半固形培地にアダプターし、ClonePix FLスクリーニングのためのプレーティング条件を確立します。安定したハイブリドーマ株で最初に条件を確立することをお勧めします。この方が、新鮮な融合細胞から始めるよりも最適化に要する時間が短くて済むからです。この段階では、数回のプレーティングを想定してください。

* プレーティングとミキシングに関する特異性プロトコールについては、「ハイブリドーマ入門」をご参照ください。

1. 凍結細胞を使用する場合は、生存率が少なくとも85％、望ましくは90％以上になるまで、約48時間解凍し継代します。
2. プレーティング当日、スピンして細胞を2mLに濃縮します。生細胞数を測定します。
3. 様々な密度の細胞を培地にプレーティングする練習します。コロニーセレクションとピッキングを成功させるためには、播種密度を最適化することが重要です。3種類の密度でプレーティングします： \( \frac{50\,\mathrm{cells}}{\mathrm{mL}} \)、\( \frac{100\,\mathrm{cells}}{\mathrm{mL}} \)、\( \frac{150\,\mathrm{cells}}{\mathrm{mL}} \)。
   　・CloneMatrix+液体ハイブリドーマ培地濃縮液（2X）。CloneMatrixは半固形濃縮液です。液体培地は、ハイブリドーマ株を支持することが知られている培地を使用します。
   　・CloneMedia Hybridoma。CloneMedia Hybridomaは、半固形培地＋マトリックス中でハイブリドーマの増殖をサポートするように最適化された培地を含むオールインワン培地です。日常的に使用されている液体培地とCloneMedia Hybridomaの組成が大きく異なる場合、培地への適応期間が必要となることがあります。
4. 蛍光検出試薬CloneDetectも同時に培地に加えます。これにより、最終濃度（100 mL中1 mL）に最小量が追加されます。
5. 固形培地を入れたプレートを、37℃、5％ CO₂の条件下で、少なくとも4日間インキュベートします。
6. 適切な時点（通常10日間）で、増殖しているコロニーの存在を光学顕微鏡で確認します。ウェルあたりのおおよそのコロニー数を測定します。理想的なプレーティングは、コロニー数(100個/ウェル)が得られることです。
7. 増殖が見られない場合は、補充が必要かもしれません。安定した株を得るには、まず以下のものを試してみることを推奨します：
   　・FBS/FCS。血清を最終濃度20～30%まで増やします。当社のCloneMedia Hybridomaには20％が含まれています。

新鮮融合を用いたハイブリドーマスクリーニングの確立

目的：新鮮な融合を用いて半固形培地での条件を最適化します。新鮮なハイブリドーマ融合をプレーティングする場合、最適な播種密度は融合の効率だけでなく、選択のカイネティックや効率にも大きく依存します。半固形培地に播種する前に、細胞は一定期間回復する必要があるかもしれません。ハイブリッドの選択を成功させるためには、適用する選択圧（すなわちHATの濃度）の最適化も必要でしょう。

1. 半固形培地にプレーティングする前に、融合を液体選択「HAT培地」中で24～48時間休ませます。
2. 樹立したハイブリドーマ用に最適化した同じ培地を使用し、最終容量100mLになるようにプレーティングします。1X HAT、優先抗生物質、L-グルタミン（最終濃度8mM）を添加します。(より安定な類似品であるInvitrogen社のGlutaMaxを推奨します）。
3. プレーティングの当日、スピンして細胞を2mLに濃縮します。総生細胞数を測定します。
4. 細胞を4種類の密度でプレーティングします： 5000, 1X104, 1X105, 1X106 cells/mL。
5. プレートを37℃、5% CO₂ の条件下で少なくとも7日間インキュベートします。