Application Note iPS細胞由来細胞を用いた細胞毒性アッセイ
- 96ウェルまたは384ウェルフォーマットで、ウェル面積の被覆率を指標として、迅速かつ簡便に細胞毒性をスクリーニング可能
- 従来のマイクロプレートリーダーのワークフローに沿った操作が可能
- 細胞を視覚的に確認できるため、データの信頼性を確保
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はじめに
薬剤誘導性の臓器毒性は、医薬品候補が市場に到達できない主な原因のひとつです。そのため、安全性および有効性を評価するための高い予測精度を持つアッセイは、創薬プロセスの改善や候補化合物の脱落率の低減において極めて重要です。成熟細胞の特性や代謝機能を示すヒト人工多能性幹（iPS）細胞由来の肝細胞や神経細胞は、創薬初期段階におけるハイコンテントスクリーニングに理想的なモデルです。
発光や蛍光による読み出しを用いた標準的な細胞毒性アッセイのプロトコールは広く知られていますが、イメージングサイトメーターを用いて実際に細胞を視覚的に観察することで、さらに多くの情報を得ることが可能です。
標準的な細胞生存率アッセイから、より多くの情報を取得する方法
Calcein AMのような生存率染色試薬は、ライブセルにおける化合物の強い毒性を評価するために使用されます。Calcein AMは、エステラーゼ活性を有する生細胞内でのみ緑色に発光します。ヒトiPS細胞由来の肝細胞は、各種化合物で24時間処理された後、Calcein AMで染色されました。ライブセルの画像は、SpectraMax® i3 マルチモードプレートリーダーにアップグレード可能なオプションである SpectraMax® MiniMax™ イメージングサイトメーターを用いて取得されました。生細胞の緑色の細胞質領域は、SoftMax® Proソフトウェアの「Cell Proliferationプロトコール」を使用して識別されました（図1および図2）。また、IC₅₀値は同ソフトウェアのカーブフィット機能を用いて算出されました（図3）。
図1. 生存率染色によりライブセルの測定が可能 Calcein AMで染色されたライブセルは、SoftMax® Proソフトウェアの「Cell Proliferationプロトコール」により識別されます。このアッセイでは、生細胞がウェル面積の何％を覆っているかを算出するために使用されます。左側の画像にはライブセルが可視化されており、右側の紫色のマスクはそれらの細胞をセグメント化した解析結果を示しています。
図2. ライブセルのコンフルエンシーを一目で把握 肝毒性試験において、結果をヒートマップで表示することで、どの化合物が毒性を示しているかを迅速に判断することができます。赤色のウェルはコンフルエンシーが高く、青色のウェルはコンフルエンシーが低く、毒性が最も高いことを示しています。図では、E〜H列に強い毒性が見られ、A列およびM〜P列には空のウェルが配置されています。
図3. カーブフィットによって算出された各化合物のIC₅₀値 SoftMax Proソフトウェアのカーブフィット機能を用いて、4種類の化合物のIC₅₀値を算出しました。
ニューロン
ニューロンにおける毒性は、セルカウントや細胞の生存率に影響を与えない場合でも、ニューロン突起の数の減少や伸長の阻害として現れることがあります。イメージングアッセイでは、細胞本体だけでなく、各細胞に付随する軸索や樹状突起も検出できるため、こうした追加情報を取得することが可能です。ヒトiPSC由来ニューロンを、384ウェルマイクロプレートに\( 5{,}000\ \text{cells/well} \)で播種しました。化合物レチノイン酸を1:2の希釈系列で、4つのウェルずつで試験し、5日間培養した後、さらに24時間の処理を行いました。処理終了後に細胞を固定し、AlexaFluor 488で直接標識したβ-チューブリン抗体で染色しました。1視野で2,000細胞以上を観察でき、これはウェル全体の約30%をカバーしています。細胞はSoftMax Proソフトウェアのセルカウントプロトコールを用いて解析しました（図4）。
図4. レチノイン酸によるニューロン突起伸長の濃度依存的な阻害 上段：レチノイン酸の濃度が高くなるにつれて（上から下へ。最上段はコントロール）、ニューロン突起の伸長量が減少しています。右列の紫色のマスクは、細胞本体および突起を識別しています。右側：レチノイン酸濃度に対するマスク領域の面積をプロットしたグラフを示しています。解析にはSoftMax Proソフトウェアを使用しました。
毒性アッセイから得られるさらなる情報
SpectraMax MiniMaxイメージングサイトメーターは、プレートリーダーによる蛍光強度の測定結果を補完する形で、視覚的および形態学的な情報を提供します。iPSC由来の肝細胞やニューロンを用いた化合物の毒性評価においては、セルカウントや細胞密度といった追加パラメーターが有用です。
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