Application Note SpectraMaxプレートリーダーで
温度制御キネティクスを効率化

Cathleen Salomo｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

はじめに

温度制御されたキネティクス測定は、酵素反応やセルベースアッセイで頻繁に使用されます。ここでは、モレキュラーデバイス製マイクロプレートリーダーの加熱要素設計に関する技術的背景と、温度制御キネティクスアッセイを実施する際の一般的なガイドラインをご紹介します。

加熱エレメントの設計

モレキュラーデバイスのマイクロプレートリーダー製品群は、加熱要素の設計や温度制御の仕組みによって異なり、表1に示すように3つのカテゴリーに分類されます。

表1：加熱要素設計のカテゴリー 3つの主要カテゴリー内で、マイクロプレートリーダーは設定可能な最大温度に違いがあります。

カテゴリー1のマイクロプレートリーダー（例：SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー）の加熱要素設計では、温度制御のためにデュアルエリアセンサーを採用しています。1つのセンサーは上部チャンバーの加熱フィルムの温度を測定し、もう1つは下部チャンバーの加熱フィルムの温度を測定します。各加熱要素は比例・積分・微分（PID）コントローラーによって独立して制御され、正確な温度調整を保証します。さらに、図1に示すように、勾配加熱設計（上部加熱フィルムを下部より高温に設定）を採用することで、接着シールやプラスチック製リッドで覆われたマイクロプレートの結露を低減します。

カテゴリー2および3のマイクロプレートリーダーも勾配加熱を採用していますが、カテゴリー1とは異なり、プレートチャンバー内に複数の加熱要素が配置されています。カテゴリー3のプレートチャンバーには、プレートキャリッジの上下に4つのヒーターが配置され、さらにキュベット用の追加ヒーターが1つあります。一方、カテゴリー2には3つのヒーター（＋キュベット用1つ）が搭載されています。2006年には、カテゴリー2および3のマイクロプレートリーダーに対して、プレートチャンバー内の熱分布を改善するためのファームウェア変更が適用されました。最新のファームウェアを確認するには、モレキュラーデバイスのテクニカルサポートチームにお問い合わせください。

勾配加熱を採用していないマイクロプレートリーダーでリッド付きマイクロプレートを使用すると、リッドの裏面に結露が発生し、測定を妨げる迷光が生じる可能性があります。これは、蛍光トップ測定や吸光度測定において特に重要です。これらの測定では、光がサンプルに到達する前にリッドを通過する必要があるためです。温度制御キネティクスで観察されるその他の問題として、蒸発、蒸発による容量変化、温度勾配による不均一性があります。次のセクションでは、温度に敏感なキネティクス測定に関する一般的な推奨事項を示します。

温度制御キネティクスに関する一般的な推奨事項

プレートリーダーのマイクロプレートチャンバー内の温度を安定させるため、実験を開始する前に温度制御をオンにすることを推奨します。マイクロプレートチャンバーが室温から設定温度（37°C～45°C）に到達するには、少なくとも15分が必要です。

温度平衡化中やアッセイマイクロプレートの温度維持中に、いわゆる「エッジ効果」がデータに現れることがあり、結果の解釈が難しくなる場合があります。エッジ効果とは、マイクロプレートの周囲のウェルで発生する蒸発がアッセイ結果に与える影響を指します。データにエッジ効果が見られる場合、実験設定を確認する必要があります。均一性を確認するには、各角と中央にコントロールウェルを配置してください。マイクロプレート全体にコントロールサンプルをロードすると、プレート全体の温度勾配の影響をより明確に把握できます。

一般的な目安として、96ウェルマイクロプレート内の100 μLの試薬を21°Cから37°Cに温めるには約30分かかります。マイクロプレートが外周から中央に向かって温まるため、全体の温度を安定させるにはさらに15～30分かかる場合があります。目的の温度への平衡化時間を短縮するには、マイクロプレートと試薬を事前に予熱することを検討してください。マイクロプレートを予熱するには、希望の温度に設定したヒートブロックにプレートを置き、予熱した試薬を添加してから、充填済みのマイクロプレートを予熱したプレートリーダーに移します。

別の方法として、ほとんどの試薬を含むマイクロプレートをプレートリーダー内で予熱し、最終試薬を予熱して反応開始直前に追加することもできます。最終試薬を予熱できない場合は、総反応量の最大1/10にとどめ、測定前に振とうして適切に混合してください。

目標温度に達すると、外周のウェルは温度維持により多くのエネルギーを必要とするため、熱対流と蒸発が増加します。このため、セルベースアッセイでは、特に高密度の384ウェルマイクロプレートなど低容量ウェルで、外周ウェルの細胞分布が不均一になることがあります。アッセイマイクロプレートの初期加温段階では、外周ウェルの蒸発率が高いため、中央ウェルに比べて温度が低下します。このエッジ効果を回避する方法の1つは、外周ウェルに水を満たし、内側のウェルのみをアッセイに使用することです。

また、ウェル間や周囲のスペースに液体を充填できるマイクロプレートや、外周にモートを備えたマイクロプレートを使用する方法もあります。このようなマイクロプレートは、エッジ効果や蒸発を低減するために開発され、セルベースアッセイに適しています。ただし、酵素アッセイでは、ウェル間スペースを満たさない方がよい場合があります。予熱した水を使用しても、追加容量により目標温度への平衡化が遅れるためです。

蒸発や隣接ウェルのコンタミネーションを防ぐために、マイクロプレートカバーを使用できます。プラスチック製リッド、シーラント、または必要に応じてミネラルオイルをカバーとして使用できます。結露リング付き透明プラスチックリッドは、ウェル間のコンタミネーションを減らし、実験中のガス交換を可能にします。このようなリッドは簡単に取り外し・再装着できるため、キネティクス実験中に試薬を追加できます。蒸発を最小限に抑える必要がある場合は、接着シートがリッドの代替として適しています。ただし、接着剤がウェル領域にあるシーラントは読み取りができないため推奨されません。非透明の接着シートは、蛍光ボトムリードモードでのデータ取得にのみ使用してください。

その他の測定（吸光度や蛍光トップリード）では、ウェル端部に強力な接着剤を備えた光学的に透明なウィンドウ付き接着シート、またはqPCRで一般的に使用される光学的に透明なヒートシールを推奨します。市販されているガス透過性の光学的に透明な接着シートもありますが、通常はガス移動率が低いです。透明カバーを通して読み取る場合、表面の反射特性により光路内の光強度が低下することを考慮してください。紫外線（UV）波長範囲で作業する場合は、ウェル底部および使用するカバー材のUV透過性を確認してください。ボトムリードの場合、アッセイ成分に干渉しない限り、ミネラルオイルも選択肢となります。ガス交換率を高める必要がある場合は、非透明でガス透過性のシーリング膜をボトムリードに使用できます。

カバーを通して読み取る必要があり、プレートリーダー内でインキュベート中に結露が発生した場合は、キネティクス測定の前または途中で振とうステップを追加し、カバー上の水滴を除去してください（材質によって結露の形成特性は異なります）。蛍光測定では、可能であればボトムリードを選択し、黒壁・透明底のマイクロプレートを使用してください。これにより、カバーの結露による迷光の影響を回避できます。

結露がプレートリーダーに入れる前に発生する場合は、取り扱いの問題である可能性があります。予熱したマイクロプレートを室温で放置する時間を最小限にし、予熱したプレートリーダーにすぐに設置してください。結露は、キネティクス測定開始時の結果を歪める可能性があります。また、プレートリーダー外でのインキュベーション温度がプレートリーダー内の温度より高い場合（例：インキュベーターで37°C、その後プレートリーダーで30°C測定）も同様です。これは吸光度および蛍光トップリードに適用されます。

キネティクス吸光度アッセイでは、アッセイ容量に依存する光路長がVmax速度や傾きの決定に影響するため、すべてのウェルで同じ容量を使用してください（図2参照）。

ここで提供する情報はアッセイ設定のガイドラインとして役立ちますが、SpectraMaxプレートリーダーで各アッセイを最適化することで、可能な限り良好な結果を得ることができます。以下は参考用の一般的なチェックリストです：

1. 使用前に、プレートリーダーのマイクロプレートチャンバーを十分に加温してください。
2. 温度勾配、蒸発、コンタミネーションなどの影響を確認するために、サンプルコントロールウェルを使用してください。
3. エッジ効果を低減するために
   ⚪︎試薬とマイクロプレートを予熱します
   ⚪︎外周ウェルの使用を避けます、または外周モート付きマイクロプレートに変更します
4. 蒸発とコンタミネーションを最小限に抑えるために、マイクロプレートカバーを使用してください。
5. リッド付きマイクロプレートで結露を防ぐために
   ⚪︎マイクロプレートの取り扱い中の温度変化を最小限にします。
   ⚪︎高温から低温へのマイクロプレート移動を避けます。
6. 蛍光アッセイは可能であればボトムリードで読み取ってください。
7. すべてのウェルで同じ容量を使用してください。

参考文献

1. Eppendorf 96-Well Cell Culture Microplate – A simple method of minimizing the edge effect in cell-based assays, Application Note 326 April 2014, Eppendorf AG, Germany
2. Thermo Scientific Nunc Edge Plate Technical Information – Intrawell Cell Distribution in MicroWell Edge Plates, Application Note, Thermo Fisher Scientific Inc, USA
3. UV Absorbance Measurements of DNA in Microplates, Evelyn
4. L. McGown, BioTechniques 28:60-64 (January 2000)
5. UV/VIS Spectroscopy in Microplates, Application Note 073 041 April 2008, Greiner Bio-One GmbH, Germany

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