Application Note SpectraMax Gemini マイクロプレーリーダーを用いた
励起および発光波長の選択 - 基本原理

はじめに

最近まで、すべてのマイクロプレートリーダーは、限られた数の励起／発光フィルターペアを備えたフィルターベースの装置であった。あるアプリケーションに対して、フィルターペアの波長は必ずしも蛍光体の最適な励起／発光波長と一致しませんでした。入手可能な最良のフィルターは、蛍光体の最適波長から20nm、30nm、あるいは50nmも離れていることが多かったです。既存のフィルターが使えない場合は、別のフィルターを購入して取り付ける必要がありました。

SpectraMax Gemini の導入により、バンドパスフィルターを使用したり、最適でない波長で妥協する必要がなくなりました。Geminiには励起モノクロメーターと発光モノクロメーターが搭載されており、250～850 nmの波長の組み合わせが簡単に得られます。このような柔軟性を考えると、ユーザーは可能な限り最良の組み合わせを選択したいと思うのは当然です。特定の蛍光体について、その選択は、励起極大と発光極大の位置と、それらの間の分離（ストークスシフト）に依存します。2つの波長が離れている場合、選択は簡単です。励起極大と発光極大を選択し、適切なカットオフフィルターを用いて残留励起光を除去し、感度を最適化します。2つの波長が近接している場合、励起光のキャリーオーバーを最小限に抑える必要があるため、選択/最適化プロセスはそれほど単純ではありません。このアプリケーションノートでは、SpectraMax Geminiマイクロプレートリーダーの励起および発光波長を最適化するための基本的な手順を示します。比較的大きなストークスシフトを持つ蛍光体（キニーネ）への適用例を示します。

概要

蛍光分析法の開発における最初のステップは、励起波長を選択することです。次のステップは、可能な限り高いシグナル／バックグラウンド比を与える発光波長とカットオフフィルターの最適な組み合わせを選択することです。一般に、10-8Mから10-6Mの蛍光体を含むサンプルは十分なシグナルを与えます。最適なシグナル／バックグラウンドの結果を得るためには、PMT（電圧）を最も高く設定してデータを取得すべきです。したがって、蛍光体の濃度は、検出器を飽和させることなく、高いPMTで発光スキャンを行うことができるように、十分に低くする必要があります。

手順

A：マイクロプレートの調製

1. マイクロプレートの1つまたは複数のウェルに200µLの検体を、もう1つまたは複数のウェルに200µLの緩衝液または溶媒を入れます。

B：励起波長の選択

1. SoftMax Proで、no cutoff filterのexcitation scan用のplate sectionを設定し、medium PMT設定を使用します。
2. emission wavelengthは、literatureのtentative value（または、蛍光体の測定に使用される一般的なフィルターセットの暫定値）に基づいて設定します。emission wavelengthのliterature valueがない場合は、以下のSection FのStep 5をご参照ください)。
3. excitation scanは、literature（または慣用の励起フィルター）から得られた暫定的なexcitation valueの約30 nm下/上で開始/停止するように設定し、1～2 nmのstep incrementを使用します。
4. スキャンを実行し、ピークのexcitation wavelength（lambda max）と最大RFU値を記録します。
5. optimal excitation wavelengthを選択します。
   　excitation lambda maxとemission wavelengthが80nm以上離れている場合は、excitation wavelengthとしてlambda maxを選択します。
   　excitation and emission wavelengthsが 80 nm 未満しか離れていない場合、モレキュラーデバイスは 90% の最大 RFU を示しました
   　lowest excitation wavelengthを選択して分離を大きくすることを推奨します。

C：cutoff filterなしのEmission Scan

ほぼ間違いなくcutoff filterが必要になりますが、このスキャンはその後のemission scanを理解し解釈するのに役立ち、cutoff filterの選択に役立ちます。

1. SoftMax Proで、cutoff filterなしのemission scan用のplate sectionを設定し、高PMT設定を使用します。励起波長を上記の励起スキャンのステップ5で決定した値に設定します。
2. literature（または既存のフィルターペア）から得られた暫定的なemission値から約50nm下/上でemission scanを開始/停止するように設定し、ステップ増分を1-2nmに設定します。スキャンを実行します。

D：Emission WavelengthとCutoff Filterの選択

Cutoff filterは、cutoff wavelength以下の光を遮断し、cutoff wavelength以上の光を透過させます。公称cutoff値は、50％の透過が起こるwavelengthです。発光Cutoff filterは、試料からの蛍光シグナルを過度に減少させることなく、できるだけ残留する励起光を遮断するように選択する必要があります。Cutoff値は最大emission wavelength付近で、excitation wavelengthより少なくとも35 nm大きいことが望ましいです。(好ましくは、カットオフ値はexcitation wavelengthとemission wavelengthの間にあるべきですが、非常に短いStokes’ shiftsの場合、最適なcutoff filterは実際には最大emission wavelengthよりも高いかもしれません！) SpectraMax Geminiのcutoff filterのwavelengthは、420, 435, 455, 475, 495, 515, 530, 550, 570, 590, 610, 630, 665, 695 nmから選択できます。

1. Emission Cutoff Filterを追加した以外は、上記のステップCと同様にして、2回目のemission scan用の plate sectionをセットアップします。スキャンを行い、最大emissionを示すwavelengthを記録します。ブランクからのプロットをチェックし、その領域に予期せぬ蛍光がないことを確認します。サンプルに最大emissionを与えるwavelengthが、選択したcutoff filterの最適emission wavelengthとなります。

E：異なるcutoff filterによるemission scan（オプション）

cutoff filterの選択に確信が持てない場合は、1つ以上の異なるcutoff filter（またはexcitation wavelengthとcutoff filterの組み合わせ）を用いて、emission scanを繰り返すとよいでしょう。必要であれば、シグナル/バックグラウンドのプロットを作成し、判断の助けとします（Maxline App. Note #31参照）

F: コメント

1. 最大emission wavelengthは必ずしもシグナル／バックグラウンド比の高いwavelengthとは限りません。ブランクに含まれる可能性のある蛍光によっては、Optimal Emission Wavelengthは最大emission wavelengthからずれることがあります。
2. 一旦emission wavelengthが指定されると、"Autofilter "機能は一般的に上記の最適化方法で使用された波長と同じカットオフフィルター波長を選択します。
3. emission wavelengthが420nm未満の場合、最適なemission wavelengthとexcitation wavelengthは、実験の反復によって決定するのが最善である。420nmのcutoff filterまたはcutoff filterなしで、emission wavelengthとexcitation wavelengthの組み合わせを試してください。同様に、excitation wavelengthが660ナノメートルを超える場合は、695 nmのcutoff filterを使用するか、cutoff filterを使用せずに、emission wavelengthとexcitation wavelengthの組み合わせを試してください。
4. 蛍光体のStokes’ shiftが極端に狭い場合は、90% max値よりもさらに低いexcitation wavelengthを用いて、emissionスキャンを繰り返すとよいです。
5. emission wavelengthが不明な場合は、暫定的なemission wavelengthを選択します。
   emission wavelengthが不明な場合は、フルオロフォアの吸光度極大値より約50 nm大きい暫定的なemission wavelengthを選択します。 吸収の最大値は、UV/Vis分光光度計でより濃度の高い蛍光色素溶液を用いて分光測定を行うことで決定できます。他の方法がすべて失敗した場合、推測に基づいてセクションBからEまでの手順を複数回繰り返す必要があります。

1.24 µMのキニーネ硫酸塩を0.01 Nの塩酸に溶解した溶液を用いた最適化手順のテスト

excitationスキャンでは、初期emission wavelengthがemission最大値に近くなくてもこの方法が機能することを示すために、初期emission wavelengthを任意に500 nmに設定しました。300～400 nmのexcitationスキャンの結果、約350 nmにexcitation peakが現れました（図1）

excitation wavelengthとemission peakの分離距離（約150 nm）が80 nmを超えていたため、選択されたexcitation wavelengthは350 nmでした。次に、cutoff filterを使用しない場合と、3種類の異なるcutoff filterを使用したemission測定を実施しました（図2）。cutoff filterを使用しない場合、emission最大値は443 nmで approximately 500 RFUでした。cutoff filterはpeakを右側に徐々にシフトさせ、最大シグナルを減少させました。特に455 nmのcutoff filterはpeakの大部分を遮断しました。

420 nmフィルターを用いたplotは、435 nmフィルターを用いたplotよりもかなり高かったが、420 nmフィルターを選択する前に、ブランク溶液（0.01 N HCl）のスキャンをチェックすることが重要でした（図3）。予想通り、cutoff filterなしのスキャンが、励起光の散乱のため最も高いシグナルを示しました。420 nmのplotは、約460 nmまでは435 nmのplotより高く、それ以上では基本的に同じでした。

最終的な決定プロセスは、発光波長の関数としてのシグナル／バックグラウンド比のplotを 作成することによって容易になりました。(これらのplotに必要な公式は、SoftMax Pro Formula Reference GuideおよびMAXline App. Note No.31にも記載されています)。420 nmのcutoff filterのシグナル／バックグラウンドのplotを図4に示します（435 nmのフィルターからのplotはわずかに、しかし一貫して低かったです）

Geminiでの硫酸キニーネの分析に最適な波長設定は、420 nm cutoff filter付きの350/470（Ex/Em）が選ばれました。

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