Application Note オルガノイドによる疾患モデル化と
in vitro薬剤スクリーニング
- 自動イメージングと解析により、オルガノイドの表現型変化を定量的に評価し、スループットを向上させます
- オルガノイドのモニタリング、メンテナンス、および特性評価のワークフローを自動化します
- 機械学習ツールを活用して、オルガノイド画像解析の複雑さを克服します
PDF版（英語）
Oksana Sirenko, PhD | Sr. Scientist | モレキュラーデバイス
Angeline Lim, PhD | Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Mary Kassinos | Cell Culture Technician | モレキュラーデバイス
はじめに
さまざまな組織を再現する3D細胞モデルは、複雑な生物学的作用、組織構造、および機能の研究に成功裏に使用されてきました。しかし、3Dモデルの複雑さは、研究や薬剤スクリーニングへの広範な採用において依然として障壁となっています。
本稿では、オルガノイドや幹細胞の成長と分化の自動モニタリング、メンテナンス、特性評価、さらにさまざまな化合物の影響を試験できる自動統合システムについて説明します。この自動統合システムには、ImageXpress® Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステム、自動インキュベーター、Biomek i7 Hybrid ワークステーション、およびロボットデバイスが含まれています。
このワークフローは、オルガノイドアッセイにおけるスループットと情報量を増加させるために、自動化と高度なハイコンテントイメージングの有用性を示しています。これは化合物スクリーニングにおいて重要です。
方法
細胞培養
3D肺オルガノイド： 3D肺オルガノイドは、ヒト肺上皮細胞（ScienCell）から誘導しました。細胞はScienCellのプロトコールに従って2Dで培養・増幅しました。3Dオルガノイド培養には、**PneumaCult™ Airway Organoid Kit（STEMCELL Technologies）**を使用し、メーカーのプロトコールに従いました。簡単に説明すると、細胞は90％Matrigel（Corning）ドームに播種し、24ウェルプレートフォーマット（1ウェルに1ドーム）で2週間、PneumaCult Airway Organoid播種用メディアを用いて隔日で給餌しました。その後、さらに6週間、PneumaCult Airway Organoid分化用メディアを用いて分化を行いました。
細胞のモニタリングとイメージング
透過光（TL）および蛍光画像は、ImageXpress Confocal HT.aiシステム（モレキュラーデバイス）を使用し、MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアで取得しました。オルガノイドについては、共焦点モードで4Xまたは10X対物レンズを用いてZスタック画像を取得しました。解析にはMetaXpressソフトウェアまたはIN Carta® 画像解析ソフトウェアを使用しました。
研究成果
3D肺オルガノイドの培養とイメージング
3D肺オルガノイドは、成長因子を含むMatrigel中で培養したヒト肺上皮細胞から作製しました。オルガノイドは透過光でモニタリングした後、染色し、自動共焦点イメージングを用いてMatrigel越しに撮像しました（図1）。画像解析には従来のツールとAIベースのツールを使用しました。発達中のオルガノイドは、空洞、突起、ベシクル構造を含む複雑な形態を持つ球状の構造体で構成されていました。サイズと複雑さの増加は、6～8週間の発達期間中にモニタリングされました。高度な画像解析により、オルガノイドの3D再構成や細胞形態、生存率、分化マーカーの複雑な解析が可能になりました。疾患表現型や化合物の影響を研究するために使用できる複数の定量的指標を特徴づけました。また、肺毒性を引き起こすことが知られている複数の薬剤の濃度依存的な影響を測定しました（図2）。
図1 A. 培養4週間後のMatrigelドーム内のオルガノイド、TL画像（4X、10X）。B. 培養6週間後のオルガノイドをHoechst染色（青）およびMitoTracker染色（赤）、10X。オルガノイドは共焦点オプションを使用して撮像、10 μm間隔で23枚のZスタック画像を取得。最大投影画像を表示。C. MetaXpressソフトウェアのCustom Module Editorを用いた画像解析。オルガノイド、細胞、細胞内構造の検出。
図2 A. 発達6週間後、オルガノイドをIbrutinib 10 μMで72時間処理。オルガノイドをHoechst核染色（青）およびEtHD-1（赤）で染色し、死細胞を検出。ImageXpress Confocal HT.aiシステムでイメージング。EtHD-1陽性（死細胞）および陰性（生細胞）数を3D解析でカウントし、EC₅₀を算出。
オルガノイド培養は、ヒト肺上皮細胞（詳細は方法の項を参照）から開始し、その後、STEMCELL Technologies社の試薬とプロトコールを用いてMatrigelドーム内でオルガノイドを成長させました。簡単に説明すると、細胞はまず2Dで増幅し、その後GF低減Matrigelと混合し、24ウェルまたは96ウェルプレートフォーマットのMatrigelドームに播種しました（図1）。
細胞培養とイメージングプロトコールの自動化
オルガノイドは疾患モデル化や化合物の影響評価に不可欠なツールです。オルガノイドの自動イメージングと解析は、オルガノイドの表現型変化を定量的に評価し、実験や試験のスループットを向上させるために重要です。
私たちは、オルガノイドや幹細胞の成長と分化の自動モニタリング、メンテナンス、特性評価、さらにさまざまな化合物の影響試験を可能にする自動統合システムを構築しました。この自動統合システムには、ImageXpress® Confocal HT.aiシステムと解析ソフトウェア、自動CO₂インキュベーター、Biomek i7液体ハンドラー、協働ロボットとレール、さらにオプションとして自動遠心機、ImageXpress® Picoシステム、プレートリーダーが含まれます。
自動化オルガノイドワークフローの構成要素
結論
- オルガノイドの開発プロセスは、複数の装置を統合することで自動化でき、化合物スクリーニングやさまざまなアッセイに使用できる3D細胞モデルの自動培養、メンテナンス、分化を提供します。
- 細胞培養は透過光でモニタリングでき、AIベースの画像解析によりオルガノイドの検出と特性評価が可能です。
- 共焦点イメージングと3D解析を組み合わせることで、オルガノイドの細胞内容の複雑かつ定量的な解析、異なる表現型を持つ細胞のカウントや測定（セルカウント、生死判定、特定マーカーのスコアリングなど）が可能になります。これらの方法は、化合物の影響試験、毒性評価、疾患モデル化に利用できます。
PDF版（英語）