Application Note SpectraMaxでHTRF設定を最適化
高精度マルチモード測定
PDF版（英語）
Caroline Cardonnel | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス
はじめに
CisbioのHTRFアッセイは進化を続け、Gタンパク質共役型受容体、キナーゼと細胞シグナル伝達、エピジェネティクス、バイオマーカーの分野を網羅するようになっています。タンパク質間相互作用、核内受容体アッセイ、受容体二量体化、リガンド結合、受容体の内部化、酵素アッセイなど、幅広い用途に対応するツールボックス試薬やキットが利用可能です。
HTRFは、ドナーとアクセプターの2種類の蛍光体を用いて、タンパク質やその他の標的バイオ分子を標識します。バイオ分子が相互作用すると、その近接性により蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）がドナーからアクセプター蛍光体へと発生します。ドナーとして長寿命蛍光ランタニドクリプテートを使用することで、HTRFアッセイの時間分解検出が可能となり、化合物やその他の材料による短寿命のバックグラウンド蛍光を最小化します。マイクロプレートリーダーを用いた時間分解FRET（TR-FRET）の検出により、バイオ分子結合の読み出しが可能です。
最良のHTRF結果を得るには、Cisbioが定めるHTRF性能仕様を満たすように検証されたマイクロプレートリーダーが必要です。リーダーの光学系、エネルギー源、検出器、さらにHTRF検出に使用する設定はすべて性能に影響します。当社のリーダーは、HTRF検出用に最適化されたコンポーネントを採用しており、SpectraMax i3xおよびParadigmマルチモードマイクロプレートリーダーにはHTRF検出カートリッジを搭載し、SpectraMax iD5リーダーには強化TRFモジュールと検証済みフィルターを備えています。
CisbioのHTRF認証プログラムは、「HTRF対応」ロゴを付与されたプレートリーダーが、最適なHTRF性能に必要な仕様を満たしていることを保証します。本テクニカルノートでは、Cisbioによって検証された、モレキュラーデバイス製HTRF対応マイクロプレートリーダーの最適化設定を紹介します。
モレキュラーデバイス HTRF適合マイクロプレートリーダー
- SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
◦HTRF検出カートリッジ（モレキュラーデバイス P/N 0200-7011、またはTb/green用のカスタムTR-FRET） - SpectraMax® iD5マルチモードマイクロプレートリーダー
◦HTRF検出システム（モレキュラーデバイス P/N 6590-0144、改良TRFモジュール、励起およびリングフィルターを含む） - SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー
◦HTRF検出カートリッジ（モレキュラーデバイス P/N 0200-7011、またはTb/green用カスタムTR-FRET） - SpectraMax® M5e マルチモードマイクロプレートリーダー
- FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダー
図1. HTRF対応SpectraMaxマルチモードリーダー。SpectraMax i3/i3xおよびParadigmリーダーにはHTRF検出カートリッジを搭載できます。SpectraMax iD5プレートリーダーは、励起および蛍光検出用フィルターを含む強化TRFモジュールを備えたHTRF検出システムを使用します。
プレートリーダー設定の推奨について
HTRFアッセイには、3種類のドナー／アクセプター蛍光体の組み合わせがあり、それぞれ最適な結果を得るために特定のプレートリーダー設定が必要です：
- ユウロピウムクリプテートドナー／レッドアクセプター（Eu/red）
- テルビウムクリプテートドナー／レッドアクセプター（Tb/red）
- テルビウムクリプテートドナー／グリーンアクセプター（Tb/green）、Tag-lite
SpectraMax i3/i3xマルチモードマイクロプレートリーダー
| Parameters | Settings | |
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor, Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
| Optical configuration | Cartridge | HTRF |
| Read mode | TR-FRET | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelengths | Fixed per cartridge | Ex 340, Em1 616, Em2 665 |
| Plate type | User selectable | White plate required for high-performance HTRF measurement |
| Read area | User selectable | |
|
PMT and optics
|
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.4 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
|
Terbium cryptate donor / green acceptor, Tag-lite |
||
|
Optical configuration |
Cartridge |
Custom TR-FRET (Tag-lite HTRF) |
|
Read mode |
TR-FRET
|
|
|
Read type |
Endpoint
|
|
|
Wavelengths |
Fixed per cartridge |
Ex 340/80, Em1 616/15, Em2 665/10 |
|
Plate type |
User selectable |
White plate required for high-performance HTRF measurement |
|
Read area |
User selectable |
|
|
PMT and optics |
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.4 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
SpectraMax Paradigmマルチモードマイクロプレートリーダー
| Parameters |
Settings |
|
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor, Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
|
Cartridge |
HTRF | |
| Read mode |
TR-FRET |
|
|
Read type |
Endpoint | |
| Wavelengths | Fixed per cartridge | Ex 340, Em1 616, Em2 665 |
| Plate type | User selectable | |
| Read area | User selectable | |
| PMT and optics |
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.4 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
| Terbium cryptate donor / green acceptor, Tag-lite | ||
| Cartridge | Custom TR-FRET (Tag-lite HTRF) | |
| Read mode | TR-FRET | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelengths | Fixed per cartridge | Ex 340/80, Em1 616/15, Em2 665/10 |
| Plate type | User selectable | |
| Plate type | User selectable | |
| PMT and optics |
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.5 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
SpectraMax iD5マルチモードマイクロプレートリーダー
| Parameters | Settings | |
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor, Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
| Read mode | TR-FRET | Enhanced TRF module must be installed |
| Read type | Endpoint | |
|
Wavelengths |
Use filters |
Ex 340/70 Em1 665/10 Em2 616/10 |
| Plate type | User selectable | |
| Read area | User selectable | |
| PMT and optics |
Flashes per read
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
50
0.05 (fixed)
0.1 ms
0.6 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
SpectraMax M5eおよびFlexStation 3マルチモードマイクロプレートリーダー
| Parameters | Settings | |
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor | ||
| Read mode | TR-FRET | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelengths | Number of wavelength pairs: 2 | Ex 314; Em1 620, with 570 cutoff; Em2 665, with 630 cutoff |
| Plate type | User selectable | White plate required for high performance HTRF measurement |
| Read area | User selectable | |
| TRF settings |
Integration delay
Integration time |
50
300 |
| PMT and optics |
Flashes per read |
50 to 100 |
| Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
| Read mode |
TR-FRET |
|
| Read type |
Endpoint |
|
| Wavelengths |
Number of wavelength pairs: 2 |
Ex 340; Em1 620, with 570 cutoff; Em2 665, with 630 cutoff |
| Plate type |
User selectable |
White plate required for high performance HTRF measurement |
| Read area |
User selectable |
|
| TRF settings |
Integration delay
Integration time |
50
300 |
| PMT and optics |
Flashes per read |
50 to 100 |
結論
時間分解蛍光検出機能を備えたSpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーは、Cisbioの標準認証方法を用いてHTRF性能の完全なテストを受け、HTRF認証の要件を超える優れた性能を示しました。Tag-liteを含むHTRFアッセイ全範囲をサポートするため、最適化された検出カートリッジやフィルターが利用可能です。
マルチモードマイクロプレートリーダーについて詳しくはこちら＞＞
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