Application Note SpectraMax L マイクロプレートリーダーでの
MycoAlertマイコプラズマ検出アッセイ（ロンザ社製）

はじめに

マイコプラズマ感染は、汚染された細胞の形態、生存率、代謝を変化させるため、細胞培養士にとってコストのかかるものです。マイコプラズマは最も小さく単純な原核生物であり、生合成能力が限られているため、多くの栄養素を宿主に完全に依存しています。マイコプラズマによる細胞培養の混入は、pH変化や濁りを生じないため検出が困難で、抗生物質による培養は、この "目に見えない "脅威を抑止する効果はほとんどないです。

Lonza Walkersville, Inc.のMycoAlert Mycoplasma Detection Assayは、特定のマイコプラズマ酵素の活性を利用した生化学的検査に基づいています。これらの酵素の存在により、迅速なスクリーニングが可能となり、検査サンプル中の汚染マイコプラズマを高感度で検出することができます。テストでは、生きているマイコプラズマは溶解し、解放された酵素はADPのATPへの転換を触媒作用させるMycoAlertの基質と反応します

MycoAlert基質の添加前と添加後の両方でサンプル中のATPレベルを測定することにより、マイコプラズマの有無を示す比率を得ることができます。これらの酵素が存在しない場合、2回目の測定値は1回目の測定値より増加しません。生きているマイコプラズマが存在する場合、MycoAlert基質中の特異性基質と反応し、ATPを生成。このATPの増加は、以下の生物発光反応を使って検出することができます：

発光強度は ATP 濃度に直線的に関係します。MycoAlert アッセイの発光シグナルは、SpectraMax® L マイクロプレートリーダーと モレキュラーデバイスの SoftMax® Pro ソフトウェアに含まれる設定済みプロトコルを使用して検出しました。

方法

MycoAlertアッセイコントロールを用いた感度試験

MycoAlert Assay Control（Lonza）の各種希釈液100µLサンプルを、白色壁の96ウェルルミノメータープレート（Porvair）のトリプリケートウェルにプレーティング。100μLのMycoAlert試薬（MycoAlert Bufferで再構成；Lonza）を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベートしました。プレートをSpectraMax L マイクロプレートリーダーにプレーティングし、SoftMax® ProソフトウェアのMycoAlertプロトコルを使用して、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を取得（読み取り値A）。100μLのMycoAlert基質（MycoAlert Bufferで再構成）を各ウェルに直ちに加え、プレートを室温で10分間インキュベートしました。プレートをSpectraMax L マイクロプレートリーダーにセットし、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を測定しました（読み取り値B）。インストゥルメンテーションの設定は表1をご参照ください。

* これらの設定は、SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みMycoAlertプロトコルに含まれています。

MycoAlert比は、Read BをRead Aで割って算出しました。

マイコプラズマ感染細胞を用いた感受性試験

マイコプラズマ・ヒオルヒニスに感染したヒト白血病細胞K562を封じ込めたフラスコから、細胞培養上清のサンプル2mLを取り出しました。細胞上清を400 x gで5分間回転させ、存在する細胞を除去。(細胞の存在はATPのバックグラウンドレベルの上昇につながり、低レベルのマイコプラズマ感染を検出する可能性があります）。

清澄化した培養上清の100µLサンプルを、白色壁の96ウェルルミノメータープレート（Porvair社製）のトリプリケートウェルにプレーティングしました。100μLのMycoAlert試薬（MycoAlert Bufferで再構成；Lonza）を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベート。プレートをSpectraMaxマイクロプレートリーダーにセットし、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を測定しました（読み取り値A）。100μLのMycoAlert基質（MycoAlert Bufferで再構成）を各ウェルに直ちに加え、プレートを室温で10分間インキュベート。プレートをSpectraMax L マイクロプレートリーダーにセットし、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を測定しました（読み取り値B）。

MycoAlert 比率は、読み取り値 B を読み取り値 A で割ることにより計算されました（図 2 参照）。マイコプラズマに感染している細胞では、通常1より大きい比率が得られます。

結果

MycoAlert アッセイは陰性サンプル中の非常に低レベルの ATP を検出するため、ルミノメーターには発生する低レベルの光を高感度で検出することが要求されます。Lonzaが提案するガイドラインでは、ルミノメーターはMycoAlertアッセイコントロールの最低1:32希釈を検出できる必要があります。

SpectraMax L マイクロプレートリーダーは、1:32 希釈以上の MycoAlert コントロールの希釈系列を直線的に検出します。低レベルの光を検出するこのルミノメーターの感度の高さは、MycoAlert の使用に適していることを証明しています。

このルミノメーターの感度テストは、マイコプラズマ感染細胞から生成されたサンプルを用いてさらに調査されました。このサンプル中のマイコプラズマの確定数は不明でしたが、MycoAlert Mycoplasma Detection AssayとSpectraMax L マイクロプレートリーダーの組み合わせにより、重要な検出方法が得られました。

結論

モレキュラーデバイスのSpectraMax L マイクロプレートリーダーとSoftMax Proソフトウェアは、Lonza社のMycoAlert Mycoplasma Detection Assayと組み合わせることで、マイコプラズマ検出分野における迅速で高感度な技術の組み合わせを研究者に提供します。高感度で検出範囲が広いため、マイコプラズマ混入がすぐに検出され、細胞培養の混入モニタリングにかかる貴重な時間を節約できます。

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