Application Note 蛍光と化学発光を組み合わせた生細胞レポーターの多重化による
NFκBシグナル伝達経路の解析

はじめに

TNF-αによるNFκB反応エレメントの活性化をモニターするために、Clontech LaboratoriesのThe chemiluminescent Ready-To-Glow Secreted Metridia Luciferase reporter systemを採用し、Clontechの蛍光ベースの ZsGreen Proteasome Sensorと組み合わせました。この複合アッセイは、モレキュラーデバイスのSpectraMax® M5 マルチモードマイクロプレートリーダーのマルチ検出能力を用いて、TNF-α誘導、NFκB依存性シグナル伝達における活性プロテアソームの必要性を直接証明するために用いられました。両方のレポーターは、96ウェルプレートの同じウェルで、細胞を溶解することなく、完全にホモジニアスな方法で測定されました。

NFkBのトランスロケーションはプロテアソームに依存

プロテアソームは、ユビキチン依存的にタンパク質を短いペプチドに分解する巨大なタンパク質複合体です。プロテアソーム活性は、NFκBに基づく転写の制御に関与しています。TNF-α刺激によってNFκBを活性化するには、IkBをリン酸化し、プロテアソームによって分解しなければなりません。プロテアソームの分解が阻害されると、NFκBの活性化が損なわれます。

ZsGreenプロテアソームセンサー

Living Colors HEK 293 ZsGreenプロテアソームセンサー細胞株（Clontech Laboratories）は、プロテアソーム活性を簡単かつ非侵襲的にモニタリングするための手法をご提供します *4。 この安定的にトランスフェクションされた細胞株は、Proteasome Sensor Vector（Clontech Laboratories）を基盤としており、wild-type ZsGreen蛍光タンパク質 *5とプロテアソーム標的配列の融合体を発現するように設計されています *6。通常、融合タンパク質であるZsProSensor-1は迅速に分解されます。しかし、プロテアソーム機能が障害を受けると、ZsProSensor-1は急速に蓄積し、蛍光マイクロプレートリーダーやフローサイトメトリーで容易に検出できます *4, *7–*8 。ZsGreen Proteasome Sensorは、これまでSpectraMax® M5マイクロプレートリーダー上でプロテアソームの活性を定量的にモニタリングするため成功裡に用いられてきました *8。

分泌型Metridiaルシフェラーゼ

Ready-To-Glow Secreted Luciferaseは、Clontechの配列最適化およびヒトコドン最適化された分泌型Metridia longa ルシフェラーゼを基盤とする化学発光型酵素報告分子です *9。分泌型Metridia ルシフェラーゼは、均一な生細胞系においてシグナル伝達経路を特徴付けるのに最適です。このアッセイは、高い倍数誘導、シグナル安定性と高輝度シグナルを示し、酵素ベースのシステムの高感度を有します *9-*10。このアッセイの高い感度と広範なダイナミックレンジにより、通常、サンプルの希釈は不要です  *11。

SpectraMax M5マルチモードマイクロプレートリーダー

SpectraMax M5マイクロプレートリーダーは、専用のシングルモードリーダーと同等のアッセイ性能を持つ、ベンチトップのデュアルモノクロメーター マルチ検出装置です。このリーダーには5つの検出モードがあります： 検出モードは、紫外可視吸光度、蛍光強度、時間分解蛍光、蛍光偏光、発光の5つです *12。

データ収集、解析、管理は、モレキュラーデバイスのSoftMax® Proソフトウェアを用いて行った。このソフトウェアは、モレキュラーデバイスのすべてのベンチトップマイクロプレートリーダーにこれらの機能を提供し、クロスプレート解析やカスタム計算を可能にします *13。

プロテアソームのステータスとNFκBシグナル伝達経路の観察

プロテアソーム活性とNFκB依存性シグナルトランスダクションを関連付けるために、プロテアソームセンサーセルラインに、NFκB反応エレメントによって駆動されるReady-To-Glow分泌型メトリジアルシフェラーゼをエンコードするレポーターベクターを一過性にトランスフェクトしました。プロテアソームの活性をモニターするためにZsGreen蛍光を用い、TNF-αの添加によるNFκBを介したNFκB反応エレメントの転写活性化を測定するためにMetridiaルシフェラーゼ化学発光を用いました。プロテアソームセンサーとReady-To-グローアッセイはともに生細胞アッセイであり、SpectraMax M5 マイクロプレートリーダーは蛍光モードと化学発光モードの両方で機能するため、測定は同一ウェル内の同一細胞でマルチプレックスフォーマットで行いました。

トランスフェクトされた細胞は、プロテアソーム阻害剤ALLN（50 µM）の存在下または非存在下、TNF-α（25 ng/mL）で誘導されました。ZsGreen蛍光シグナルを用いて細胞のプロテアソーム活性をモニターし、次に分泌されたMetridiaルシフェラーゼ基材を同じウェルに加え、化学発光シグナルを測定しました。

ALLN非存在下では、低レベルのZsGreenしか観察されず、プロテアソームが活性化してZsProSensor-1タンパク質を分解していることが示されました。プロテアソーム阻害剤ALLNで処理していない細胞にTNF-αを誘導すると、トランスフェクト細胞の培地上清に高レベルのメトリジアルシフェラーゼレポーターが検出され、NFκB反応エレメントが活性化し、分泌型メトリジアルシフェラーゼの発現を駆動していることが示されました。(図1参照）。

高レベルのMetridiaルシフェラーゼシグナルは、ALLNの非存在下およびTNF-αの存在下でのみ観察されました。プロテアソームがALLNによって不活性化されると（ZsProSensor-1蛍光レベルの増加によってモニターされます）、NFkBシグナル伝達経路はTNF-α刺激に効果的に反応できなくなります。ALLN = N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal。

しかしながら、ALLNの存在下で細胞をTNF-αで処理すると、高レベルのZsGreen蛍光が測定され、プロテアソームが不活性化されたことが示されました。TNF-α誘導にもかかわらず、Metridiaルシフェラーゼ転写レポーターは低レベルしか検出されず、NFκBが効果的に活性化されていないことが示されました（図1参照）。これらの結果を総合すると、TNF-α誘導性のNFkB依存性シグナル伝達にはプロテアソーム活性が不可欠であることがわかります（図2参照）。

結論

プロテアソームセンサーとReady-To-Glowシステムを組み合わせることにより、TNF-αによる誘導でNFκBが転写を開始するには、活性プロテアソームが必要であることが、生細胞の単一培養で観察されました（図2）。したがって、IkBのリン酸化／解離がNFκBシグナル伝達に十分であるという古典的見解は不完全です。

SpectraMax M5 マイクロプレートリーダーと付属の SoftMax Pro ソフトウェアにより、実験を次のように統一することができました：ZsGreen 蛍光測定の直後に、Metridia ルシフェラーゼ基質を同じウェルに添加し、化学発光を測定しました。両方の測定値は、同じ細胞から、同じ装置で、同じソフトウェアを使って取り込まれました。こうして、TNF-αによって誘導されるプロテアソーム活性とNFκB依存性シグナル伝達が同時にモニターされました（図1）。

従来、マルチプレックスアッセイのデザインは、（a）異なる蛍光タンパク質をマルチプレックスして生細胞アッセイを作るか、（b）異なるルシフェラーゼをマルチプレックスして溶解ベースアッセイを作るかに限られていました。しかし、Metridiaルシフェラーゼは細胞溶解に依存しない分泌型レポーターであるため、蛍光と化学発光ベースのレポーター系を初めてマルチプレックスすることができ、両者の利点を1つの均一性 生細胞アッセイに統合することができました。同じウェル内で蛍光と化学発光の生細胞アッセイをマルチプレックスすることで、インテリジェントなアッセイ開発の新たな道が開かれます。

謝辞

Clontech LaboratoriesはモレキュラーデバイスのCathy Olsen氏の技術協力に感謝する。

参考文献

1. Adams, J. (2002) Trends Mol Med 8(4 Suppl):S49–S54.
2. Haas, M. et al. (1998) J Leukocyte Biol 63(3):395–404.
3. Sun, L. and Carpenter, G. (1998) Oncogene 16(16):2095–2102.
4. Proteasome Sensor Vector. (April 2003) Clontechniques XVII(2):14.
5. Matz, M. V. et al. (1999) Nature Biotech 17(10):969–973. Erratum in Nature Biotech 17(12):1227.
6. Li, X. et al. (1998) J Biol Chem 273(52):34970–34975.
7. Living Colors Cell Lines. (April 2004) Clontechniques XVII(2):14.
8. Measurement of proteasome inhibition in live cells in Molecular Devices microplate fluorometers. (2006) SpectraMax Application Note. Molecular Devices.
9. Ready-To-Glow Secreted Luciferase System. (July 2006) Clontechniques XXI(2):12–13.
10. Ready-To-Glow Dual Secreted Reporter System. (October 2006) Clontechniques XXI(3):1.
11. Detection Limit and Linear Range of Ready-To-Glow Secreted Metridia Luciferase Determined on the Molecular Devices SpectraMax L. (July 2007) Clontechniques XXII(3):20–21.
12. SpectraMax M5/M5 e multi-detection reader: A five-mode microplate reader with threemode cuvette port. Molecular Devices Data Sheet (2006).
13. SoftMax Pro Software: The industry standard in microplate data analysis. Molecular Devices Data Sheet (2006).

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