Application Note エンドトキシンモニタリングに最適な
SpectraMax ABS Plusの活用方法

はじめに

Joyce Itatani ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Cathy Olsen｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

製薬業界や医療機器業界において、製造工程中のコンタミネーションを監視することは重要なステップです。頻繁に検出されるコンタミナントであるエンドトキシンは、発熱、炎症、頭痛、吐き気、さらには死に至ることもあります。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在し、従来から高感度かつ特異的なLimulusアメボサイトリセート（LAL）アッセイによって検出されてきました。エンドトキシンの存在下では、カブトガニ（Limulus polyphemus）由来のLALが酵素媒介カスケードを介して凝固し、ゲルクロット法、比濁法、または比色法で定量できます。

Lonza社のPYROGENT™-5000 キネティック比濁LALアッセイは、LAL凝固を時間経過に伴う濁度の増加としてモニタリングするキネティックアッセイです。この濁度変化は吸光度プレートリーダーでキネティック測定できます。初期に存在するエンドトキシン量が多いほど、反応開始時間（オンセットタイム）は短くなります。これは、サンプルの吸光度が初期値より所定量増加するまでに必要な時間です。オンセットタイムと標準濃度の標準曲線を作成し、サンプル中のエンドトキシン量を算出します。このアッセイは、0.001〜10 EU/mLの範囲でエンドトキシンを検出できます。

材料

• PYROGENT-5000 カイネティックLALアッセイ（Lonza)
• 96-well 透明 LAL Reagent Grade™ マルチウェルプレート（Lonza）
• パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza）
• LAL試薬水（Lonza）
• SpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

SSpectraMax ABS Plusリーダーは、アッセイ設定前に37 °Cに加温しました。

試薬の再構成

• **Control Standard Endotoxin（CSE）**は、キットに添付された分析証明書に記載された量のLAL試薬水（LRW）で再構成し、100 EU/mLの溶液を得ました。バイアルは15分間ボルテックスしました。
• LAL試薬は、キットの指示に従ってLAL再構成バッファーで再構成しました。

標準曲線

• 10.0 EU/mLのエンドトキシン溶液は、100.0 EU/mLのストックから0.1 mLを取り、0.9 mLのLAL試薬水に加えて調製しました。
• 10 EU/mLから0.001 EU/mLまでの1:10希釈系列をLRWで作成し、標準曲線用としました。
• 各エンドトキシン標準液100 µLを、LAL試薬グレードのマルチウェルプレートの3連ウェルに添加しました。
• 標準液を含むマイクロプレートは、予熱したSpectraMax ABS Plusリーダー内で37 °Cで10分間インキュベートしました。
• その後、各ウェルにLAL試薬100 µLを添加し、SoftMax® Proソフトウェアの事前設定済みキネティック比濁LALプロトコールを使用して、キネティック測定を直ちに開始しました。装置設定は表1に示します。

表1. SpectraMax ABS Plusプレートリーダーでのキネティック比濁アッセイの装置設定。SoftMax Proソフトウェアのキネティック比濁LALプロトコールには最適な設定が含まれており、結果解析を自動化します。（MeanValue = 平均オンセットタイム）

データ解析

SoftMax ProソフトウェアのData Reductionダイアログでは、以下を除きパラメータはデフォルト値に設定しました：

• 最初のデータポイントをゼロに設定
• Kinetic Reduction：オンセットタイム（Onset OD = 0.03）

ソフトウェアにより平均オンセットタイムが計算され、エンドトキシン標準濃度に対してプロットされました。

結果

0.001〜10 EU/mLの範囲の代表的な標準液のキネティックトレースを図1に示します。オンセットタイムは赤い縦線で示されています。各標準液の平均オンセットタイムは、SoftMax Proソフトウェアにより標準濃度に対してプロットされました（図2）。

図1. 代表的な標準液のキネティックトレース。赤い縦線はオンセットタイムを示します（Onset OD = 0.03）。

図2. エンドトキシン標準曲線。平均オンセットタイム（秒）とエンドトキシン標準濃度を、SoftMax Proソフトウェアでログ-ログカーブフィットを用いてプロットしました（n = 3, r² = 0.996）。

PYROGENT-5000アッセイマニュアルによると、性能要件は以下の通りです：

• 計算された標準曲線の相関係数（r）の絶対値は ≥0.980であること
• 反応時間の%CVは10％未満であること

SpectraMax ABS Plusプレートリーダーで生成された標準曲線では、r = 0.998であり、要求値0.980を超えています。SoftMax Proソフトウェアで計算された標準液の3連測定の%CVは、各標準液で10％未満でした（表2）。同等の結果はSpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーでも得られています（データ非表示）。

表2. SoftMax Proソフトウェアの標準グループテーブルで計算された値。各標準液の%CVは10％未満であり、PYROGENT-5000アッセイキットマニュアルに示された再現性要件を満たしています。

結論

Limulusアメボサイトリセート（LAL）テストは、多くの医薬品や医療機器製品におけるエンドトキシンレベルの測定に関して、米国薬局方（USP）で認められています。定量的なキネティックPYROGENT-5000アッセイは、エンドトキシンの存在を検査するためのハイスループットな方法を提供し、0.001 EU/mLまで検出できるため、さまざまなサンプルタイプで安全なエンドトキシンレベルを確保する効果的な手段となります。SpectraMax ABS PlusプレートリーダーとSoftMax Proソフトウェア、さらにPYROGENT-5000アッセイを組み合わせることで、SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みプロトコールを使用した自動結果計算により、エンドトキシン試験のワークフローを効率化できます。