Application Note プレートリーダーを用いた
イメージングサイトメトリーによるマーカー発現測定

  • イメージングサイトメーター機能により、プレートリーダーのアプリケーションを拡大
  • セルまたはウェルごとのマーカー発現レベルを簡単に測定
  • 使い慣れたマイクロプレートリーダーのワークフローに従います
  • セル可視化によるデータ出力の信頼性
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はじめに

細胞タンパク質の有無は、刺激に対する反応、分化の状態、特異的な細胞タイプの仕様、あるいは遺伝子トランスフェクションの成功を示すことがあります。例えば、血管接着分子-1（VCAM-1）の表面発現は、正常な血管内皮には通常見られませんが、in vitroではサイトカインTNF-αによって刺激され、炎症反応を引き起こすことがあります。このような細胞内のタンパク質発現は、イメージングサイトメトリーを用いて容易に可視化することができ、また容易に定量化することができます。

細胞におけるマーカー発現の定量的測定

ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を96ウェルプレートで48時間培養した後、抗炎症化合物のSB202とSB203で用量を変えて2時間処理しました。処理後、VCAM-1の発現をTNF-αで24時間刺激。その後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、抗VCAMフルオレセイン標識抗体で染色しました。画像は、SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダーのフィールドアップグレードオプションであるSpectraMax® MiniMax™ イメージングサイトメーターを用いて取得。画像解析は、SoftMax® Proソフトウェアのマーカー発現プロトコルを用いてOn-the-flyで行いました。化合物の有効性は、SoftMax Proソフトウェアの用量反応曲線で評価され、抗炎症化合物がサイトカイン刺激から細胞を保護し、その後のVCAM-1発現を抑制したかどうかが示されました。

VCAM-1の発現レベルは、低バックグラウンド蛍光をフィルタリングするための強度閾値と、傷、ほこり、泡などの微小なアーチファクトをフィルタリングするためのサイズ閾値を設定して定量しました。図1は、SoftMax Proソフトウェアにおけるマーカー発現プロトコルの視覚的ガイド付きセットアップを示しています。

図1. プレート読み取り前の陽性および陰性サンプルの解析パラメーターのテスト。SoftMax® Proソフトウェアのインターフェースには、画像セグメンテーションに最適なパラメータを設定するためのビジュアルコンポーネントがいくつか用意されています： 1: バックグラウンド強度と対物レンズサイズの閾値を調整し、蛍光セルを識別します。2: 陽性ウェルと陰性ウェルのセグメンテーションマスクを表示して、さらに調整が必要かどうかを確認します。3: 棒グラフに見られるように、陽性ウェルと陰性ウェルで大きな差が得られる出力パラメーターを選択します。Marker Expression Protocolは、フルオレセイン標識抗VCAM抗体で標識されたセル領域を同定するために使用します。VCAM-1の存在は、炎症反応が陽性であることを示す。

図1. プレート読み取り前の陽性および陰性サンプルの解析パラメーターのテスト。SoftMax® Proソフトウェアのインターフェースには、画像セグメンテーションに最適なパラメータを設定するためのビジュアルコンポーネントがいくつか用意されています： 1: バックグラウンド強度と対物レンズサイズの閾値を調整し、蛍光細胞を識別。2: 陽性ウェルと陰性ウェルのセグメンテーションマスクを表示して、さらに調整が必要かどうかを確認します。3: 棒グラフに見られるように、陽性ウェルと陰性ウェルで大きな差が得られる出力パラメーターを選択します。Marker Expression Protocolは、フルオレセイン標識抗VCAM抗体で標識された細胞領域を同定するために使用します。VCAM-1の存在は、炎症反応が陽性であることを示します。

フルオレセイン標識抗VCAMで染色した固定細胞をMarker Expression Protocolで同定します。細胞はほぼコンフルエントであるため、プロトコールは個々の細胞を分割する代わりに、視野内の全体的なマーカー発現を測定するように設定されています。

図2. 抗炎症性化合物による治療に対する細胞の反応。左の画像は蛍光イメージャーVCAM-1を発現している細胞を示し、右の紫色のマスクは炎症マーカーを示す細胞のセグメンテーションを示している。高用量の抗炎症化合物SB202で処理したセル（上段）はVCAM-1をほとんど発現していないが、非常に低用量のSB202で処理したセル（下段）はサイトカインで刺激され、大量のVCAM-1を発現した。値は正規化した総シグナル強度で示した。

図2. 抗炎症性化合物による治療に対する細胞の反応。左の画像は蛍光イメージングVCAM-1を発現している細胞を示し、右の紫色のマスクは炎症マーカーを示す細胞のセグメンテーションを示しています。高用量の抗炎症化合物SB202で処理した細胞（上段）はVCAM-1をほとんど発現していませんが、非常に低用量のSB202で処理した細胞（下段）はサイトカインで刺激され、大量のVCAM-1を発現しました。値は正規化した総シグナル強度で示しました。

図3. マーカー発現結果の解析。上：プレートテンプレートの注釈付きウェル。下： 平均マーカー発現量と化合物濃度のプロット。抗炎症化合物の濃度が高くなるにつれて、サイトカイン刺激によるVCAM-1発現量は減少する。正規化された全シグナル強度は、多くのカーブフィット処理オプションの一つでプロットすることができ、IC50濃度を決定することができる。SB202 IC50= 0.1 µM、SB203 IC50=1.8 µM。

図3. マーカー発現結果の解析。上：プレートテンプレートの注釈付きウェル。下： 平均マーカー発現量と化合物濃度のプロット。抗炎症化合物の濃度が高くなるにつれて、サイトカイン刺激によるVCAM-1発現量は減少します。正規化された全シグナル強度は、多くのカーブフィット処理オプションの一つでプロットすることができ、IC50濃度を決定することができます。SB202 IC50= 0.1 µM、SB203 IC50=1.8 µM。

マーカー発現アッセイからより多くの情報を

SpectraMax MiniMaxイメージングサイトメーターは、ウェル内の単純な蛍光強度を超える可視化と情報を提供します。測定された蛍光エリアは、目的のマーカーを発現している細胞に限局され、大きな蛍光イメージャーにより、一度に多数の細胞を調べることができます。SoftMax Proソフトウェアを用いた直感的な解析により、用量反応曲線のプロットやIC50値の算出が可能です。MiniMaxイメージングサイトメーターは、細胞イメージングを簡素化し、細胞内のマーカー発現を測定する標準的なプレートリーダーアッセイを補う結果を提供します。

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