Application Note 細胞ライセートの総タンパク質測定を
SpectraMax ABS Plusで効率化

はじめに

Joyce Itatani｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Cathy Olsen, PhD｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

細胞ライセート中のタンパク質濃度の定量は、ウエスタンブロットやELISA（酵素免疫測定法）など、多くの後続アプリケーションにおいて重要なステップです。最も一般的なアッセイの2つは比色法であり、タンパク質の存在に応じて試薬の色が変化することに依存しています。Bradfordタンパク質アッセイは、Coomassieブルー染料の吸光度が465 nm（非結合）から595 nm（結合）へシフトすることに基づいています。一方、BCA（ビシンコニン酸）アッセイは2つの反応に依存します：（1）タンパク質がCu²⁺をCu¹⁺に還元し、（2）ビシンコニン酸がCu¹⁺に結合して紫色の錯体を形成し、562 nmで強く光を吸収します。

ここでは、Pierce Rapid Gold BCAアッセイとPierce Detergent Compatible Bradfordアッセイを用いて、細胞ライセート中の総タンパク質を定量する方法をご紹介します。標準的なBCAアッセイでは37°Cで30分間のインキュベーションが必要ですが、Rapid Gold BCAアッセイでは室温でわずか5分間のインキュベーションで済み、吸光度は480 nmで測定します。Detergent Compatible Bradfordアッセイは、Coomassie染料を界面活性剤を含むバッファーで溶解した細胞に使用する際に生じる問題を解決します。

両方のアッセイはSpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーで測定しました。SoftMax® Proソフトウェアの事前設定済みプロトコールを使用してデータを取得し、標準曲線を作成して細胞ライセートの濃度を算出しました。Rapid Gold BCAアッセイとDetergent Compatible Bradfordアッセイの両方で、使用した細胞ライセートに対して類似した結果が得られました。

材料

• Pierce Rapid Gold BCAタンパク質アッセイキット (ThermoFisher)
• Pierce Detergent Compatible Bradfordアッセイキット (ThermoFisher)
• RIPA Buffer (ThermoFisher)
• ハルトプロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテル (ThermoFisher)
• グライナー透明96ウェルマイクロプレート（Greiner Bio-One）
• CHO-K1細胞（ATCC）
• SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

注記：ここで説明するアッセイでは、SpectraMax ABSおよびSpectraMax PLUS 384 マイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られます。

方法

細胞ライセートの調製

CHO-K1細胞のT-75フラスコから培地を除去し、カルシウムとマグネシウムを含む冷PBSで10 mL洗浄しました。PBSを除去後、RIPAバッファー2 mLをフラスコに加え、完全な溶解を確実にするため室温で5分間インキュベートしました。Haltプロテアーゼ阻害剤を最終濃度1Xでライセートに添加しました。ライセートを分割し、2本の1.5 mLマイクロチューブに移し、14,000 rpmで20分間遠心しました。PBSで上清の1:3希釈系列を作成し、細胞および溶解バッファー濃度の範囲でアッセイ性能を評価しました。

標準曲線

両方のタンパク質アッセイについて、アッセイキットの手順に従い、25 µg/mLから2000 µg/mLまでのウシ血清アルブミン（BSA）標準液を調製しました。

Rapid Gold BCAアッセイ

BSA標準液または細胞ライセート20 µLを96ウェルマイクロプレートのウェルに分注（n = 3）し、続いて200 µLのワーキング試薬（Reagent A:Reagent B = 50:1）を加えました。プレートを30秒間シェーカーで混合し、その後室温で5分間インキュベートしました。吸光度はSpectraMax ABS Plusリーダーで480 nmで測定しました。

Detergent Compatible Bradfordアッセイ

BSA標準液または細胞ライセート10 µLを96ウェルマイクロプレートのウェルに分注（n = 3）し、各ウェルにDetergent Compatible Bradford試薬300 µLを加えました。ウェルの内容物を数回ピペッティングして混合し、室温で10分間インキュベートしました。吸光度はSpectraMax ABS Plusリーダーで595 nmで測定しました。

データ解析

SoftMax Proソフトウェアで二次曲線フィットを用いて標準曲線を作成し、細胞ライセートの濃度を標準曲線から自動計算しました。

結果

Rapid Gold BCAアッセイとDetergent Compatible BradfordアッセイのBSA標準曲線を図1に示します。SoftMax Proソフトウェアは各アッセイの標準曲線から細胞ライセート濃度を自動計算しました。

図2はRapid Gold BCAアッセイで得られたデータテーブルを示し、細胞ライセートの各希釈の濃度が計算されています。細胞ライセートの平均濃度は683 µg/mLと算出されました。図3はDetergent Compatible Bradfordアッセイのデータテーブルを示し、平均濃度は673 µg/mLで、BCAアッセイの結果と類似しています。

Mean Adjusted Result: 683.3 図2. Rapid Gold BCAアッセイ結果。SoftMax Proソフトウェアのデータテーブルには、細胞ライセートの段階希釈に対して計算された濃度が示されています。

Mean Adjusted Result: 672.9 図3. Bradfordアッセイ結果。SoftMax Proソフトウェアのデータテーブルには、Detergent Compatible Bradfordアッセイで計算された細胞ライセート濃度が示されています。

結論

Pierce Rapid Gold BCAアッセイとPierce Detergent Compatibleタンパク質アッセイは、長時間のインキュベーションや界面活性剤の影響を心配することなく、細胞ライセートサンプル中の総タンパク質を定量する簡便な方法を提供します。Rapid Gold BCAアッセイは、より線形な標準曲線と希釈細胞ライセートにわたる一貫した結果を示しましたが、全体的な結果は両方のキットで類似していました。

SpectraMax ABS PlusプレートリーダーとSoftMax Proソフトウェアは、データ取得と解析の完全なソリューションを提供し、標準曲線の作成とサンプル濃度の自動計算を可能にします。Speed Read設定を使用すれば、96ウェルプレートをわずか5秒で読み取ることができ、タンパク質定量のプロセスをさらに効率化します。

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