Application Note NanoBRETアッセイによる
p53-MDM2タンパク質相互作用の測定方法

はじめに

Joyce Itatani ｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Cathy Olsen, PhD｜シニア・アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス

BRET（Bioluminescence Resonance Energy Transfer）は、発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用を利用して、タンパク質間またはタンパク質-リガンド間の相互作用を測定する技術です。ドナーとアクセプターが10 nm以内に近接すると、ドナーがアクセプターを励起し、アクセプターが蛍光を発します。関心のあるタンパク質の一方にドナーを、結合パートナーにアクセプターをタグ付けすることで、マイクロプレートリーダーを用いてドナーとアクセプターから発せられる光を検出し、タンパク質間相互作用を測定できます。

Promega社のNanoBRET™テクノロジーは、より明るい発光ドナー（NanoLucルシフェラーゼ）、最適化されたエネルギーアクセプター（HaloTag®-NCT）、およびドナーとアクセプターの波長間の広い分離を組み込むことで、BRET1やBRET2を含む従来のBRET技術を改良しています（図1）。これらの改良により、シグナルの増強、感度の向上、バックグラウンドの低減が実現し、生細胞内でのタンパク質間相互作用の検出が可能になります *1。

NanoBRETシグナルの検出とデータ解析には、高感度な装置と高度なソフトウェアが必要です。SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax® Proソフトウェアを使用することで、最適化されたフィルターセットを用いてNanoBRETデータを取得し、カーブフィッティングを含む解析を適用できます。本稿では、SpectraMax iD5プレートリーダー上で、相互作用するタンパク質ペアp53とMDM2からなるNanoBRET™ PPIコントロールペアを用いたマイクロプレートリーダーの検証について説明します。p53経路の活性化剤であるnutlin-3を用いて、p53-MDM2相互作用を濃度依存的に阻害し、その結果をSoftMax Proソフトウェアで解析・グラフ化しました。

材料

• NanoBRET PPI コントロールペア (p53, MDM2; Promega)
• NanoBRET Nano-Glo ® 検出システム (Promega)
• ViaFect™ トランスフェクション試薬 (Promega)
• Nutlin-3（ミリポア-シグマ）
• Opti-MEM™ 還元血清培地、フェノールレッド不使用 （ThermoFisher）
• 293(HEK-293)セル (ATCC)
• イーグル最小必須培地（EMEM、Corning）
• BenchMark™ ウシ胎児血清（Gemini Bio-Products）
• ペニシリン-ストレプトマイシン（10,000 U/mL、ThermoFisher）
• 6ウェルクリアマイクロプレート（VWR）
• 96ウェル白色平底ポリスチレン・マイクロプレート（Corning）
• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
  ⚪︎ドナーフィルター： ドナーフィルター：447 nm BW 60 nm（モレキュラーデバイス）
  ⚪︎アクセプターフィルター：610 nm LP（モレキュラーデバイス）

方法

HEK-293細胞を細胞培養培地（EMEM + 10% FBS + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン）に懸濁し、400,000 cells/mLで6ウェルプレートに2 mL/well（800,000 cells/well）で播種しました。細胞は37°C、5% CO₂で4～6時間付着させ、その後、p53-HaloTag融合ベクターDNA 2 μgとNanoLuc-MDM2融合ベクターDNA 0.2 μgを、フェノールレッドを含まないOpti-MEM Reduced-Serum Medium 100 μL中で、ViaFectトランスフェクション試薬:DNA比3:1でトランスフェクトしました。細胞は37°C、5% CO₂で20～24時間インキュベートしました。

HEK-293細胞を1,000 rpmで5分間遠心し、培地を除去しました。細胞密度をOpti-MEM + 4% FBSで2.2 × 10⁵ cells/mLに調整し、2本の15 mLコニカルチューブに分注しました。一方にはHaloTag 618 Ligand 0.1 μMを添加し、もう一方にはリガンドを添加しませんでした。細胞は96ウェル白色マイクロプレートに2 × 10⁴ cells/wellで播種し、直ちにnutlin-3の1:3段階希釈液（各濃度n = 4）または0.5% DMSOで処理しました。細胞は37°C、5% CO₂で一晩インキュベートしました。

NanoBRET Nano-Glo基質の5X溶液をOpti-MEM + 4% FBSで調製し、各ウェルに25 μL添加しました。ドナー発光（447 nm）とアクセプター発光（610 nm）はSpectraMax iD5プレートリーダーで、表1に示す設定を用いて測定しました。NanoBRET比はSoftMax Proソフトウェアでアクセプターシグナルをドナーシグナルで割って算出し、比に1000を掛けてmilliBRET単位（mBU）を得ました。mBU値はリガンド非添加サンプルの平均mBUを差し引いてバックグラウンド補正しました。nutlin-3処理細胞の結果はSoftMax Proソフトウェア（バージョン7.0.3以上）で4パラメータカーブフィットを用いて解析・グラフ化しました。各濃度のnutlin-3でZ’因子を算出し、アッセイ性能を評価しました。

*Read heightは使用するマイクロプレートに合わせて最適化してください。表1. SpectraMax iD5プレートリーダーでのNanoBRET検出設定

結果

NanoBRET比（mBU）とnutlin-3濃度の関係をSoftMax Proソフトウェアで4パラメータカーブフィットを用いてグラフ化しました（図2）。nutlin-3のIC₅₀値は1.2 μMで、Promega社がNanoBRET PPIコントロールペアで示した結果と一致しました *2。

図2に示したカーブを生成するために使用したすべてのnutlin-3濃度で、Z’因子は少なくとも0.7を示しました。0.07 μM以下の濃度では、Z’因子は0.9でした。これらの値は、このNanoBRETアッセイの堅牢性と低い変動性を示しています。

結論

NanoBRETドナーおよびアクセプターシグナル検出用の最適フィルターを搭載したSpectraMax iD5プレートリーダーは、NanoBRET PPIコントロールペア（p53、MDM2）を用いた本アッセイで検証されました。nutlin-3は濃度依存的にp53-MDM2相互作用を阻害し、期待されるIC₅₀値1.2 μMを示しました。アッセイ性能と再現性を評価するために算出したZ’因子はすべての濃度で0.7～1の範囲にあり、SpectraMax iD5プレートリーダーの高感度とNanoBRETアッセイの堅牢性を確認しました。SoftMax ProソフトウェアはNanoBRET比の自動計算とデータのグラフ化を行い、解析を効率化しました。

参考文献

1. Machleidt T, Woodroofe CC, Schwinn MK, Mendez J, Robers MB, Zimmerman K, Otto P, Daniels DL, Kirkland TA, and Wood KV. NanoBRET—A Novel BRET Platform for the Analysis of Protein-Protein Interactions. ACS Chem. Biol. 2015, 10, 1797–1804.
2. Technical Manual: NanoBRET Protein: Protein Interaction System. Promega Corporation.