Application Note SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーでの
発光細胞生存能および細胞毒性アッセイ

はじめに

モレキュラーデバイス SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーを細胞生存率および細胞毒性用の発光アッセイと組み合わせることで、培養中の生存細胞数を高感度かつ迅速に測定し、実験処理による細胞毒性効果を定量化することができます。プロメガのCellTiter-Gloアッセイは、光を発生させるためにATPを必要とするルシフェラーゼ酵素を使用します。このアッセイで生成される発光シグナルは、培養物中のATP量に依存し、その量は生存細胞数に依存します。BioVision社のBioluminescence細胞毒性アッセイキットは、アデニル酸キナーゼ（AK）の測定に基づいています。アデニル酸キナーゼは、すべての細胞に存在するユビキタスタンパク質で、細胞膜の完全性が失われると培地中に放出されます。AKはADPをATPに変換し、発光反応によって検出されます。

材料

• CellTiter-Glo 発光細胞生存能アッセイ (Promega)
• 生物発光細胞毒性アッセイキット（BioVision）
• HeLa細胞（ATCC）
• 黒色/透明96ウェル組織培養プレート（Corning）
• ソリッド白色96ウェル組織培養プレート（Corning）
• ソリッド白色384ウェル組織培養プレート（Greiner）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー

方法

試薬の調製

CellTiter-Glo Buffer と基質は使用前に解凍し、室温に平衡化しました。CellTiter-Glo Buffer のボトルの内容物を CellTiter-Glo Substrate の入った琥珀色のボトルに移し、キットの技術資料に記載されているとおり、内容物を優しく逆さにして混合しました。

Bioluminescent Cytotoxicity Assay Kit の場合、AK 検出試薬のバイアルを 1.1 mL の AK Assay Buffer で再構成し、穏やかに混合した後、室温で 15 分間平衡化させました。このAKストック試薬をアッセイバッファーで10倍に希釈し、AK検出試薬ワーキング溶液としました。

細胞数と発光シグナルの相関関係

HeLa細胞を、10％ウシ胎児血清ペニシリン／ストレプトマイシン添加MEM中で培養しました。細胞をトリプシン処理し、培地に懸濁し、カウントしました。96ウェルアッセイフォーマットでは、1ウェル当たり50,000細胞から10細胞までの連続希釈液を、1ウェル当たり100μLの細胞懸濁液でプレーティングしました。384ウェルフォーマットでは、1ウェル当たり12,500から6細胞までの連続細胞希釈液を、1ウェル当たり25µLでプレーティングしました。バックグラウンド発光値を得るために、細胞を含まない培地を封じ込めたコン トロールウェルを用意しました。

細胞標準曲線用の正確な細胞数を確保するため、細胞を直ちにアッセイしました。100μL（96ウェルアッセイ）または25μL（384ウェルアッセイ）のCellTiter-Glo試薬を各ウェルに添加しました。プレートをプレートシェーカーで 2 分間穏やかに混合した後、室温で 10 分間インキュベートし、発光を安定化させました。

ATP standard curves

ATPの1:10希釈系列をソリッド白色96ウェルプレートと384ウェルプレートに10uMから1nMまでの濃度でセットアップし、細胞を封じ込めなかったブランクウェルも加えました。ATPの測定にはCellTiter-Gloアッセイを用いました。最良の結果を得るために、マイクロプレートの最適化とread height optimizationを行いました。

細胞生存率および細胞毒性アッセイ

HeLa細胞を96ウェル組織培養処理白色または透明底マイクロプレートに1ウェル当たり15,000個播種し、一晩接着増殖させました。翌日、細胞にスタウロスポリンとアニソマイシンを添加してアポトーシスを誘導しました。化合物は1：2希釈系列として、最高濃度50μMから始めて24nMまで添加しました。化合物で24時間処理した後、細胞をCellTiter-GloおよびBioVision細胞毒性キットでアッセイしました。

細胞生存率アッセイでは、100μLのCellTiter-Glo試薬を、処理細胞を封じ込めたソリッド白色プレートの各ウェルに添加しました。細胞溶解のため、試薬添加後約 10 分後にプレートを読み取りました。

BioVision 細胞毒性キットの場合、各処理ウェルから培地 100 µL を除去し、ソリッド白色プレートに移しました。各ウェルにAK試薬作業溶液100µLを添加し、30分以内にプレートを読み取りました。

機器設定とサンプル分析

SpectraMax i3x プレートリーダーの設定は、表 1 に示すように行った。

平均RLUおよび標準偏差の計算、細胞希釈系列およびATP標準曲線のグラフ化、IC₅₀曲線生成のための4-parameter curve fittingは、SoftMax® Proソフトウェアを用いて行いました。CellTiterGlo アッセイ用の設定済みプロトコールは、ソフトウェアのプロトコールライブラリに含まれています。

*SoftMax ProソフトウェアのMicroplate Optimization Wizardを使用して、384ウェルマイクロプレートプレートの定義を最適化しました。
**Read Height Optimization Wizardを使用して、各アッセイに最適なシグナルを検出できるようにread heightを最適化しました。

表1. 発光測定用の機器設定

結果

SpectraMax i3xプレートリーダーは、96ウェルおよび384ウェルアッセイフォーマットの両方で、ウェルあたりわずか10個の細胞を検出することができました。したがって、標準的な比色分析法およびほとんどの蛍光分析法の検出限界以下の細胞数で測定することができます。CellTiter-Gloアッセイは、使用した細胞濃度の全範囲にわたって直線的で、測定範囲は3桁以上に及び、決定係数は0.99を超えていました（図1）。

ATP standard curvesは、アッセイ性能の検証や細胞内ATP含量の算出に使用できます。ここでは、1 nMから10 uMまでのATP標準物質の発光シグナルは、今回アッセイした細胞数で観察された発光出力の全範囲をカバーしていました（図2）。測定は少なくとも4桁のオーダーにわたって直線性を示しました。

化合物スタウロスポリンとアニソマイシンで処理した細胞について、ATPレベルを測定することにより細胞生存率をアッセイし（図3）、アデニル酸キナーゼ酵素をアッセイすることにより細胞毒性をアッセイしました（図4）。どちらのアッセイでも、スタウロスポリン（それぞれ0.34 µMと0.15 µM）およびアニソマイシン（3.30 µMと2.28 µM）については同様のIC₅₀値が得られました。

結論

SpectraMax i3x プレートリーダーは、ATPベースの細胞生存率およびアデニル酸キナーゼベースの細胞毒性アッセイ用の発光アッセイにおいて優れた感度を提供し、ウェルあたりわずか10個の細胞を検出することができます。 Four-parameter curve fittingとIC₅₀値の算出は、すべてSoftMax® Proソフトウェア内で行われます。マイクロプレートとread height optimization wizardsは、最適なシグナル検出を保証し、ソフトウェアによって自動化されます。

発光アッセイに加えて、SpectraMax i3x プレートリーダーは、CellTiter-Glo および BioVision 細胞毒性アッセイと、追加の検出モードを必要とする他のアッセイとのマルチプレックス要件をご提供します。このマルチモードプレートリーダーは、特許取得済みの Spectral Fusion™ 照明による吸光度検出と蛍光強度検出を提供し、シグナル強度を最大化しながら波長の柔軟性を実現します。

時間分解蛍光検出やウェスタンブロット検出を含むユーザー交換可能なカートリッジや、オプションのSpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーター モジュールを追加することで、リーダーの検出機能が拡張され、他のリーダーをはるかに上回るアプリケーションオプションが可能になります。すべての機器は、SoftMax Proソフトウェアを使用して操作します。SoftMax Proソフトウェアには、CellTiter-Gloをはじめとする120以上のアッセイ用の設定済みプロトコルが含まれており、データの収集と解析を容易にします。

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