Application Note ImageXpress Picoによる神経突起伸長の化合物評価
- 神経突起伸長に対する化合物特異的な影響を評価
- 多重測定による神経ネットワークの広がりと複雑性の定量的解析
- in vitroでの神経発生および神経変性の研究にアッセイを活用
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はじめに
Oksana Sirenko｜シニア・リサーチ・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス
神経突起伸長は、試験管内で神経細胞の発生と変性を研究するための一般的なアッセイ法です。神経突起の発達には、細胞外シグナルと細胞内シグナルの複雑な相互作用が必要です。神経突起の成長は、神経栄養因子によって刺激されたり抑制されたりします。重要なことは、神経突起の発達は神経毒性のある化学物質によって影響を受ける可能性があるということです。
私達は、発達中の神経系に悪影響を及ぼす化合物の能力を測定するために、ImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムを用いて神経突起伸長アッセイを評価しました。このアッセイは、神経細胞が神経突起を伸ばして完全な神経ネットワークを形成するという、神経系の発達における重要なプロセスであることから選択されました *1,*2。一般的に、神経突起伸長は最も一般的な指標として報告されているが *3,*4、総分岐や総過程などのパラメータは、化合物が神経突起伸長を阻害する可能性のある別の様式を表している可能性があります。
われわれは、神経突起伸長に対する化合物の特異性を評価しました。この評価には、マルチプレックス測定による神経ネットワークの広がりと複雑さの定量的な特性評価も含まれます。神経突起伸長の表現型は、複数の測定値を用いて特徴づけられました。神経突起伸長は、神経突起の伸長範囲（全アウトグロースの長さまたは細胞あたりの平均アウトグロース）、神経突起の数（全プロセス数）、および分岐の程度（全分岐数および細胞あたりの平均分岐数）によって特徴付けられました。
材料
- iPSC 由来ニューロン（Human Neuronal Kit, NEURO KIT, XK-001-1V, エクセルサイエンス）
- ポリ-D-リジンプレコート384ウェルプレート（Corning Biocoat）
ラミニン（Sigma-Aldrich） - Hoechst (ThermoFisher Scientific)
- Hank's Balanced Salt Solution（Life Technologies）
- ImageXpress Pico 自動細胞イメージングシステム（モレキュラーデバイス）
- CellReporterXpress ® 画像取得および解析ソフトウェア（モレキュラーデバイス）
方法
iPSC由来ニューロンは、ポリ-D-リジンでコートされた384ウェルプレート（\( \frac{3.3\ \text{mg}}{\text{mL}} \)ラミニン処理済み）に播種されました。各ウェルには1万個の細胞を播種し、化合物処理の前にiCell Neuron Maintenance Mediumで48時間培養しました。これらの細胞では、播種後2時間で神経突起ネットワークの形成が始まり、培養10〜12日まで複雑性が増加します。ニューロンはメーカー推奨に従い14日間培養した後、384ウェルプレート上で6段階濃度（0.3〜100 μM）にわたって72時間処理されました。神経突起伸長への影響は、総突起長、分岐数、突起数、およびウェルあたりの生存細胞数を定量することで評価されました。濃度依存的な応答はEC₅₀値を用いて解析されました。
細胞は、37°C・5% CO₂環境下で72時間にわたり化合物に曝露されました。次に培地を除去し、4%ホルムアルデヒドで固定後、2回洗浄を行いました。その後、AF-488標識ファロイジン（1:100希釈）とHoechst 33342（1 µM）を含む滅菌済みHank’s Balanced Salt Solutionで2時間インキュベートしました。神経突起伸長および細胞生存率のマーカーとしてCalcein AMを使用しました。インキュベーション後、染色液を0.1%ウシ胎児血清（FBS）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に置換し、画像取得を行いました。
各ウェルからの画像は、ImageXpress Picoシステムを用いて10倍対物レンズで取得されました。通常、384ウェルプレートの各ウェルにつき1枚の10倍画像が撮影されます。10倍対物レンズは、1枚の画像あたり200個以上の細胞を含む神経突起ネットワークや細胞内構造を識別するのに十分な分解能を提供し、これはウェル全体の約6分の1の領域に相当します。解析は、神経突起トレース用モジュールを備えたCellReporterXpressソフトウェアを使用してオンザフライで実行されました。図1は、DMSO処理されたニューロンの代表的な拡大画像であり、神経突起トレースのオーバーレイが表示されています。
結果
化合物処理により神経突起ネットワーク形成の用量依存的な阻害が観察されました（図2）。本実験で取得された画像の定量解析では、培養ニューロンの形態的特徴および神経ネットワークの広がりと複雑性を評価するための複数のパラメーターが導出されました。また、化合物による細胞毒性の推定のため、画像内の細胞体の総数も定量化されました。細胞の播種および神経突起伸長は実験全体を通して非常に一貫性があり均一であったため、統計解析には画像あたりのニューロン総数を使用しました。細胞ごとの突起長や突起数、分岐数も測定されましたが、冗長性のため統計解析には使用していません。化合物の毒性作用は、神経突起伸長、分岐数、突起数、生存細胞数に対する4パラメータカーブフィットから導出されたEC₅₀値（神経突起伸長の50%阻害濃度）により比較可能です。図2では、各化合物（1 µM）における神経突起ネットワークの総長（総突起長）の濃度依存的なカーブを示し、神経毒性の可能性を評価し、さらなる毒性評価の優先順位付けに活用しています。図3および図4では、10 µM濃度で試験された神経毒性化合物を示しています。
図2. 神経突起ネットワークの破壊は、各化合物（1 µM）で処理されたニューロンに対して測定されました。神経突起伸長の減少に基づいて定義されたEC₅₀値は、ロテノンで6 µM、メチル水銀で0.07 µMでした。分岐点の減少に基づいて定義されたEC₅₀値は、ロテノンで3 µM、メチル水銀で0.07 µMでした。
図3. 10μM濃度で試験した神経毒性化合物の画像。
図4. 10μM濃度で試験した神経毒性化合物の平均神経突起伸長。
結論
このアッセイは、神経突起伸長のさまざまなモジュレーターやin vitro神経毒性作用の研究に有用です。
参考文献
- Harrill, J.A., Robinette, B.L., Freudenrich, T., Mundy, W.R., 2013. Use of high content image analyses to detect chemical-mediated effects on neurite sub-populations in primary rat cortical neurons. Neurotoxicology 34, 61–73.
- Sanes, D.H., Reh, T.A., Harris, W.A., 2006. Development of the Nervous System. Elsevier Academic Press, Burlington, MA.
- Radio, N.M., Breier, J.M., Reif, D.M., Judson, R.S., Martin, M., Houck, K.A., et al., 2015. Use of neural models of proliferation and neurite outgrowth to screen environmental chemicals in the ToxCast Phase 1 library. Appl. In Vitro Toxicol. 1 (2), 131–139.
- Stiegler, N.V., Krug, A.K., Matt, F., Leist, M., 2011. Assessment of chemical-induced impairment of human neurite outgrowth by multiparametric live cell imaging in high-density cultures. Toxicol. Sci. 121, 73–87
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