Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーで
均一型・ハイスループットエピジェネティクスアッセイ

はじめに

エピジェネティクスは、細胞分裂の間で安定して維持され、世代間で遺伝する可能性はありますが、DNAの配列自体を変えない遺伝子発現の変化を指します。エピジェネティクスは、生物の多くの重要な機能を制御しており、幹細胞の機能やがんとの関連性は、現在活発に研究されている分野です。

多くのエピジェネティクス研究は、ヒストンとその関連タンパク質との相互作用に焦点を当てています *1。ヒストンのリジン残基のアセチル化は、遺伝子の転写をエピジェネティックに制御するのに重要です。アセチル化されたヒストンは、ブロモドメインとして知られる小さなタンパク質ドメインを通して認識され、タンパク質と結合します。そのようなタンパク質の一つがBRD4で、BETファミリーのメンバーであり、そのメンバーは炎症、遺伝子発現、有糸分裂、その他の細胞プロセスに関与しています *2。ブロモドメイン／ヒストン相互作用の低分子阻害剤がヒト疾患の治療薬になる可能性があります *3。

Cayman ChemicalのBRD4ブロモドメイン1（BRD4-B1）キットは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）を用いて、ブロモドメイン／アセチル化ペプチド相互作用の阻害剤を迅速に特性評価します（図1）。TR-FRETドナーはEu³⁺キレート標識BRD4-B1タンパク質で、ビオチン化ペプチドリガンドに結合します。TR-FRETアクセプターは、ビオチン部分を介してペプチドリガンドに結合したアロフィコシアニン（APC）標識アビジンからなります。阻害化合物などによりBRD4-B1/リガンド相互作用が阻害されると、TR-FRETシグナルが消失します。時間分解検出を用いることで、シグナル対ノイズ比が向上し、化合物の蛍光の影響を最小限に抑えることができるため、TR-FRETアッセイは特にハイスループットスクリーニングアプリケーションに有用です。このアプリケーションノートでは、BRD4ブロモドメイン1 TR-FRETアッセイキットとSpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーを組み合わせて使用し、BRD4の既知の阻害剤を使用してIC₅₀データを取得します。Z' factorは0.91で、スクリーニングに適した堅牢なアッセイであることを示しています *4。

図1. BRD4 bromodomain 1 TR-FRET アッセイキットのアッセイ概略図。ユーロピウムが励起されると、APCがユーロピウムに近接していれば、ユーロピウムキレートは光子を放出するか、そのエネルギーをAPCに伝達することができます。

材料

• BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay Kit (Cayman Chemicals)
• JQ-1（+）阻害剤（Cayman Chemicals）
• 384ウェル低容量ソリッドブラックプレート (Cayman Chemicals)
• ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma）
• SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax® M5eマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

アッセイのセットアップと検出

BRD4 bromodomain 1 TR-FRET アッセイは、アッセイキットのマニュアルに記載されているとおりに実施しました。1μMから始まるJQ1の2倍希釈系列（DMSO中）を調製しました。アッセイは、表1に示すプレーティングスキームと容量を用い、低容量の384ウェルブラックプレートにセットアップしました。室温で1時間インキュベートした後、SpectraMax i3プレートリーダー、SpectraMax Paradigmプレートリーダー、SpectraMax M5eプレートリーダーで、表2に示す最適化設定を用いてプレートを読み取りました。SpectraMax i3およびSpectraMaxマイクロプレートリーダーでは、各ウェルの中心から正確に読み取るためにマイクロプレートの最適化を行いました。

表1. ブロモドメインTR-FRETアッセイキットのピペッティングスキーム。

表2.SpectraMax i3およびSpectraMax Paradigmプレートリーダーの最適化された設定。検出カートリッジには励起光源と光学系が含まれています。時間分解蛍光検出を搭載した SpectraMax M5 プレートリーダーにも同様の Wavelength、delay、integration settingsを用いました。

別の実験では、Z' factorを計算するために、ビークル対照と10μM(+)-JQ1 inhibitor controlをそれぞれ168複製した。ビークル対照には、阻害剤のアッセイ条件に合わせるため、8％DMSOを含むアッセイバッファーを封じ込めた。Z' factorは前述の方法で算出しました *4。

結果

テストした3台のSpectraMaxリーダーすべてで、ロバスト性の結果が得られました。SpectraMax i3プレートリーダーで検出された(+)-JQ1の代表的な阻害曲線を図2に示します。このデータをSoftMax® Proソフトウェアで4-parameterのロジスティック方程式に当てはめ、IC₅₀値を111 nMと算出しました。これは、アッセイキットのマニュアルに記載されている77 nMという値と一致しています。図3に示すように、計算されたZ' factorは0.91であり、このアッセイはハイスループットスクリーニングに最適です。

図2. JQ1(+) control （IC₅₀ = 111 nM）の濃度を減少させながら処理したBRD4-BR1の阻害剤反応曲線

図3. BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay Kitの典型的なZ' factorデータ。(+)-JQ1control wellsには10μM阻害剤を封じ込め、ビークル対照には8%DMSOを含むアッセイバッファーを封じ込めました。この実験から計算されたZ' factorは0.91でした。赤の破線は、各コントロール値の平均からの3標準偏差に対応します。

結論

BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay KitとSpectraMaxプレートリーダーを組み合わせることで、正常な有糸分裂とDNA複製を担うブロモドメインとアセチル化ペプチド間の相互作用の阻害剤をスクリーニングするための、高感度で信頼性の高いソリューションをご提供できます。このアッセイは、ますます重要性を増しているエピジェネティクスの分野において、新しい治療薬を発見するための有用なツールを研究者にご提供します。

参考文献

1. DeAngelis JT, Farrington WJ, Tollefsbol TO. An overview of epigenetic assays. Molecular Biotechnology 38.2 (2008)： 179-183.
2. Filippakopoulos P, et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature 468.7327 (2010): 1067-1073.
3. Dimond PF. Epigenetics targets may enable discovery of novel drugs. Gen Eng. & Biotech. News, 24 Oct. 2013. Web. 30 Jan. 2015
4. Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR. 1999. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screening 4.2 (1999)： 67-73.