Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーで
ハイスループットなエピジェネティクス解析を実現

はじめに

エピジェネティクスは、DNA配列自体を変化させることなく、細胞分裂間で安定し、世代間で遺伝する可能性のある遺伝子発現の変化を伴います。エピジェネティクスは生物の多くの重要な側面を制御しており、幹細胞機能やがんにおける役割は現在も活発に研究されています。

多くのエピジェネティクス研究は、ヒストンとそれに関連するタンパク質の相互作用に焦点を当てています *1。ヒストンのリジン残基のアセチル化は、遺伝子転写のエピジェネティック制御において重要です。アセチル化されたヒストンは、ブロモドメインと呼ばれる小さなタンパク質ドメインを介してタンパク質に認識され、結合します。その一例がBRD4で、BETファミリーに属するタンパク質です。このファミリーは炎症、遺伝子発現、有糸分裂などの細胞プロセスに関与しています *2。ブロモドメインとヒストンの相互作用を阻害する低分子化合物は、ヒト疾患の治療薬としての可能性を秘めています *3。

Cayman ChemicalのBRD4 bromodomain 1（BRD4-B1）キットは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）を使用して、ブロモドメインとアセチル化ペプチドの相互作用阻害剤を迅速に評価します（図1）。TR-FRETドナーはEu³⁺キレート標識BRD4-B1タンパク質で、ビオチン化ペプチドリガンドに結合します。TR-FRETアクセプターは、ビオチン基を介してペプチドリガンドに結合したアロフィコシアニン（APC）標識アビジンで構成されます。阻害化合物によってBRD4-B1とリガンドの相互作用が阻害されると、TR-FRETシグナルが失われます。時間分解検出を使用することで、シグナル対ノイズ比が向上し、化合物蛍光の影響を最小限に抑えることができるため、TR-FRETアッセイはハイスループットスクリーニングに非常に有用です。本テクニカルノートでは、BRD4 bromodomain 1 TR-FRETアッセイキットとSpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーを組み合わせ、既知のBRD4阻害剤を用いてIC₅₀データを取得しました。Z’因子は0.91であり、このアッセイがスクリーニングにおいて信頼性が高いことを示しています *4。

図1. BRD4 bromodomain 1 TR-FRETアッセイキットのアッセイスキーマ 励起後、ユウロピウムキレートは光子を放出するか、近接している場合にAPCへエネルギーを移動できます。

材料

• BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay Kit (Cayman Chemicals)
• JQ-1（+）阻害剤（Cayman Chemicals）
• 384ウェル低容量ソリッドブラックプレート (Cayman Chemicals)
• ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma）
• SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax® M5eマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

アッセイのセットアップと検出

BRD4 bromodomain 1 TR-FRETアッセイは、アッセイキットのマニュアルに記載された手順で実施しました。JQ1（DMSO中）の2倍希釈系列を1 μMから調製しました。アッセイは、表1に示すピペッティングスキームと容量を用いて、低容量384ウェルブラックプレートでセットアップしました。室温で1時間インキュベートした後、SpectraMax i3プレートリーダーで表2に示す最適化設定を使用してプレートを測定し、さらにSpectraMax ParadigmリーダーおよびSpectraMax M5eプレートリーダーでも測定しました。SpectraMax i3およびSpectraMax Paradigmプレートリーダーでは、各ウェルの中央から正確に読み取るためにマイクロプレートの最適化を行いました。

表1. ブロモドメインTR-FRETアッセイキットのピペッティングスキーム

表2. SpectraMax i3およびSpectraMax Paradigmプレートリーダーの最適化された装置設定　検出カートリッジには、記載された励起光源と光学系が含まれています。SpectraMax M5プレートリーダーでは、オンボードの時間分解蛍光検出を使用し、類似の波長、ディレイ、および積分設定を使用しました

別の実験では、Z’因子を算出するために、ビークルコントロールと10 μM（+）-JQ1阻害剤コントロールをそれぞれ168リプリケートで実施しました。ビークルコントロールには、阻害剤のアッセイ条件に合わせて8％DMSOを含むアッセイバッファーを使用しました。Z’因子は既報の方法で算出しました *4。

結果

3種類のSpectraMaxプレートリーダーすべてで信頼性の高い結果が得られました。SpectraMax i3プレートリーダーで検出した（+）-JQ1の代表的な阻害曲線を図2に示します。データはSoftMax® Proソフトウェアで4パラメータロジスティック式にフィットし、IC₅₀値は111 nMと算出され、アッセイキットマニュアルに記載された77 nMの値と一致しました。図3に示すように、算出されたZ’因子は0.91であり、このアッセイがハイスループットスクリーニングに非常に適していることを示しています。

図2. BRD4-BR1に対する（+）-JQ1コントロールの濃度減少に伴う阻害応答曲線（IC₅₀ = 111 nM）

図3. BRD4 bromodomain 1 TR-FRETアッセイキットの典型的なZ’因子データ（+）-JQ1コントロールウェルには10 μM阻害剤を含み、ビークルコントロールウェルには8％DMSOを含むアッセイバッファーを使用しました。この実験で算出されたZ’因子は0.91でした。赤の破線は各コントロール値の平均から3標準偏差を示します

結論

BRD4 bromodomain 1 TR-FRETアッセイキットとSpectraMaxプレートリーダーを組み合わせることで、有糸分裂やDNA複製に関与するブロモドメインとアセチル化ペプチドの相互作用阻害剤をスクリーニングするための高感度で信頼性の高いソリューションを提供します。このアッセイは、重要性が増しているエピジェネティクス分野において、新しい治療薬候補の探索に有用なツールです。

参考文献

1. DeAngelis JT, Farrington WJ, Tollefsbol TO. An overview of epigenetic assays. Molecular Biotechnology 38.2 (2008)： 179-183.
2. Filippakopoulos P, et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature 468.7327 (2010): 1067-1073.
3. Dimond PF. Epigenetics targets may enable discovery of novel drugs. Gen Eng. & Biotech. News, 24 Oct. 2013. Web. 30 Jan. 2015
4. Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR. 1999. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screening 4.2 (1999)： 67-73.