Application Note SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイキットによる
高感度デュアルルシフェラーゼ検出

  • 1ウェルあたり10細胞以下でのFireflyおよびRenillaルシフェラーゼ発現の検出
  • レポーター発現をコントロールに対して正規化することで、測定結果の精度を高めます
  • SoftMax Proの設定済みプロトコールにより、迅速なデータ解析が可能
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はじめに

ホタルルシフェラーゼは、遺伝子の制御と機能を研究するために広く使われているレポーターです。哺乳類の細胞や組織には内因性のルシフェラーゼ活性がないため、非常に感度の高いレポーターです。ホタルルシフェラーゼは62kDaのタンパク質であり、単量体として活性を持ち、活性のための後の処理は不要です。D-ルシフェリンのATP依存的酸化を触媒し、その結果発光します（図1A）。ウミシダ類Renilla由来のルシフェラーゼは、トランスフェクション効率を正規化し、遺伝子制御と機能を研究するための第二のレポーターとして、多重ルシフェラーゼアッセイでしばしば使用されます。Renillaルシフェラーゼは、酸素によるコエレテラジン酸化を触媒して光を生成します（図1B）。

図1. (A)ホタルルシフェラーゼと(B)レニラルシフェラーゼが触媒する生物発光反応。

SpectraMax® DuoLuc™ リポーターアッセイキットは、哺乳動物細胞中のホタルおよびRenillaのルシフェラーゼを高感度に定量することができます。最適化された2種類の検出試薬を連続注入することにより、同じマイクロプレートウェル内でルシフェラーゼをアッセイすることができます。ホタルの作用液をインジェクションで自動添加すると、ホタルルシフェラーゼの発光反応が開始され、その後2回目のインジェクションでRenillaの作用液を添加すると、ホタルの発光が消光され、Aquaphile™ コエンテラジンが添加されてRenillaの反応が開始されます。その結果、2シグナルアッセイシステムとなり、コントロールに対する実験シグナルの標準化が可能となります。このアッセイはSpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー with Injector Cartridge and SmartInject™との使用に最適です。

材料

  • SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイキット（モレキュラーデバイス、カタログ番号R8361）
  • HeLa細胞 (ATCC)
  • pGL4.13[luc2/SV40] ホタルルシフェラーゼ発現ベクター (Promega)
  • pGL4.75[hRluc/CMV]Renillaルシフェラーゼ発現ベクター (Promega)
  • ViaFect™ Transfection Reagent (プロメガ社)
  • Opti-MEM 還元血清培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
  • SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
    ◦SmartInject付きSpectraMaxインジェクターカートリッジ

方法

細胞トランスフェクション

HeLa細胞を6ウェル組織培養処理プレートに1ウェルあたり2x105細胞で播種し、トランスフェクションの前に37℃/5% CO2で24時間インキュベートしました。pGL4.13[luc2/SV40]ホタルルシフェラーゼ発現ベクターをOptiMEM培地で1μg/μLに希釈し、pGL4.75[hRluc/CMV]Renillaルシフェラーゼ発現ベクターを100ng/μLに希釈しました。3本のチューブを以下のようにセットし、穏やかに混合しました： 400μLのOpti-MEM培地＋2μL（2μg）のpGL4.13[luc2/SV40]ホタルルシフェラーゼ発現ベクター＋2μL（2ng）のpGL4.75[hRluc/CMV]Renillaルシフェラーゼ発現ベクター。各チューブに6μLのViaFect試薬を加え、内容物を軽く叩いて混合しました。チューブを室温で10分間インキュベートし、複合体を形成させました。200µLのトランスフェクション複合体を6ウェルプレートの各ウェルに滴下し、軽く振り混ぜました。

細胞はトランスフェクション後48時間、37℃/5% CO2でインキュベートされ、その後アッセイのために採取されました。

細胞溶解物の調製

6ウェルプレートにトランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、10個のアリコートに分け、1500rpmで5分間ペレット化し、PBSで1回洗浄しました。PBSを除去し、細胞ペレットをアッセイ時まで-80℃で保存しました。

アッセイ準備のため、Passive Lysis Bufferと細胞ペレットを室温に温め、各細胞ペレットを150μLのPassive Lysis Bufferで溶解しました。細胞溶解は室温で15分間行いました。その後、溶解液を Passive Lysis Buffer で 1:2 に連続希釈し、ウェルあたり 12～8700 個の細胞に相当する濃度の標準曲線を作成しました。各濃度の細胞溶解液20 µLを白色96ウェルプレートの3連ウェルにピペッティングしました。

ルシフェラーゼアッセイのセットアップ

キットの全成分を室温まで解凍しました。Firefly Substrateは、2.2mgの凍結乾燥基質を含むバイアルに220μLの水を加えて再構成しました。Aquaphile coelenterazineは、440 µgの凍結乾燥基質を含むバイアルに220 µLの水を加えて再構成しました。注：記載されている再構成量はExplorer Kitのものです。他のキットサイズについては、製品添付文書をご参照ください。

ホタル発光反応溶液は、ホタル基質をホタルアッセイ緩衝液で1:50に希釈して調製しました。レニラ作業溶液は、Aquaphile coelenterazineをRenillaアッセイ緩衝液で1:50に希釈して調製しました。96ウェルプレート1枚につき、220μLのそれぞれの基質を加えて11mLの作業溶液を作製しました。

SoftMax® Proソフトウェアであらかじめ設定されたSpectraMax DuoLucアッセイプロトコルを用いて、以下のパラメータでアッセイを実行し、結果を解析しました：

  1. インジェクター 1 を使用し、100 µL のホタルワーキング溶液をウェルに添加します。
  2. 2秒遅らせて反応を発現させます。
  3. 積分時間 5 秒でホタルの発光を測定します。
  4. インジェクター 2 を使用し、100 µL のRenilla作業溶液をウェルに添加します。
  5. 2秒間遅延させて反応を展開させます。
  6. 積算時間 5 秒でRenilla発光を測定します。
  7. 各アッセイウェルについて、1 回目の測定値（ホタルルシフェラーゼ）と 2 回目の測定値（Renillaルシフェラーゼ）の RLU 値を正規化します。

SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイキットの性能を競合他社のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイと比較しました。

細胞溶解物の調製

6ウェルプレートにトランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、10個のアリコートに分け、1500rpmで5分間ペレット化し、PBSで1回洗浄しました。PBSを除去し、細胞ペレットをアッセイ時まで-80℃で保存しました。

アッセイ準備のため、Passive Lysis Bufferと細胞ペレットを室温に温め、各細胞ペレットを150μLのPassive Lysis Bufferで溶解しました。細胞溶解は室温で15分間行いました。その後、溶解液を Passive Lysis Buffer で 1:2 に連続希釈し、ウェルあたり 12～8700 個の細胞に相当する濃度の標準曲線を作成しました。各濃度の細胞溶解液20 µLを白色96ウェルプレートの3連ウェルにピペッティングしました。

アッセイ性能

SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイキットを用いた細胞サンプルの相対発光単位は、試験した全範囲においてサンプル濃度に直線的に比例し、得られた標準曲線のr2値は1.0でした（図2）。CV値はすべての反復測定で4%以下でした（n=3）。直線性の高いデータと低い%CV値の利点は、幅広い細胞反応におけるルシフェラーゼ発現の違いを正確に検出できることです。これにより、シグナル伝達、タンパク質間相互作用、その他多くの分野での科学的発見につながる、実験的細胞条件に対する小さな反応の同定が可能になります。

図2. セルベースアッセイstandard curve。
ホタル（red plot）とRenilla（blue plot）の標準曲線は、SoftMax Proソフトウェアのlog-log curve fit を用いてプロットしました（それぞれr2 = 1.0）。各細胞数でN=3反復。

SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイキットを用いて得られたstandard curveは、競合他社のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイの標準曲線と同等です（図3）。低い%CV値、インジェクターチューブへの試薬の非吸収、Renilla基質添加時のホタルシグナルの適切な消光など、デュアルルシフェラーゼアッセイに使用される装置に要求される性能基準は、SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイキットを使用したインジェクターカートリッジ付きSpectraMax i3xで実行されます（データは示されていません）。

図3. 競合他社のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイのデータ。
RFU値および直線性は、SpectraMax DuoLucレポーターアッセイキットで示されたものと同等です。各細胞数でN=3反復。

SoftMax Proソフトウェアには、あらかじめ設定されたアッセイプロトコルが用意されており、各ウェルのホタル発光をレニラ発光で割ることにより、正規化されたルシフェラーゼ値を計算するという利点があります。結果はグループ表に表示され、結果の共有や発表のために簡単にグラフ化することができます。ここでテストした細胞溶解物の正規化値を図4に示す。これらは、今回アッセイした濃度範囲で一貫しており、ウェル内の細胞数が変動しても、アッセイ結果は一貫していることが実証されました。

図4. 正規化ホタル発光単位対細胞濃度。
細胞濃度。SoftMax Proソフトウェアが自動的に計算し、ホタルルシフェラーゼの発光値をRenillaの値に対して正規化してグラフ化しました。各細胞数でN=3反復。

結論

SpectraMax DuoLuc Reporterアッセイは、インジェクターカートリッジ付きSpectraMax i3xリーダー上で性能が最適化されます。データ取得と解析を簡略化するための設定済みプロトコールと、SoftMax Proソフトウェアにより、高速、高感度、高信頼性のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を得るためのトータルソリューションが完成します。

参考文献

  1. Alam, J. and J.L. Cook. 1990. Anal. Biochem. 188:245-254.
  2. Bronstein, I., et al. 1994. Anal. Biochem. 219:169-181.
  3. Gould, S.J. and S. Subramani. 1988. Anal. Biochem. 175:5-13.
  4. Brasier, A.R., et al. 1989. BioTechniques. 7:1116- 1122
  5. Bhaumik, S., et. al. (2004) J Biomed Opt. 9, 578-86.
  6. Matijasevic, Z., et. al.(2001) Carcinogeneis. 22, 661-4.
  7. Nieuwenhuijsen BW., et.al. (2004) J Biomol Screen. 8, 676-84
  8. Matthews, J.C., Hori, K. and Cormier, M.J. (1977) Biochemistry 16, 85-91
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