Application Note Beacon Analytical Systemsメラミンプレートキットによる
ハイスループットなメラミン検出

はじめに

有機塩基メラミンは、プラスチック、難燃剤、顔料、肥料など、多くの製品の製造に使用されています。最近、動物飼料や人間が消費する食品にメラミンを添加し、タンパク質の含有量を偽装する行為が最近報告されています。メラミン汚染は動物や人間に重篤な病気や死を引き起こす可能性があるため、様々な食品中のメラミン汚染を検出する方法の特定に関心が高まっています。このアプリケーションノートでは、Beacon Analytical Systems社のメラミンプレートキットの紹介とバリデーションを行います。

Beacon Melamine Plate Kitは、汚染サンプル中のメラミンを定量分析するための競合型酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）です。このキットを使用して、乳製品、小麦グルテン、ウェットおよびドライペットフードなど、さまざまな種類のサンプルを測定できます。メラミンは、抽出液と混合または振とうすることで検体から抽出されます。メラミンHRPコンジュゲート、検体抽出液、キャリブレーターを、メラミン抗体でコートした検査ウエルにピペッティングします。30分間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して未結合のメラミンを除去し、基質をウェルに添加します。30分後に反応を停止し、吸光マイクロプレートリーダーを用いてウェルの吸光度を測定します。 テストサンプルのメラミン濃度は、メラミンstandard curveから内挿法により算出されます。

モレキュラーデバイスの吸光マイクロプレートリーダーは、メラミンアッセイの吸光度を検出するために使用されます。モレキュラーデバイスのAquaMax® 4000マイクロプレートウォッシャーが、すべてのマイクロプレートウェルを同時に吸引・分注し、必要な洗浄ステップを迅速に完了します。データ収集と解析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準解析ソフトウェアであるSoftMax® Pro GxPソフトウェアであらかじめ設定されたメラミンELISAプロトコルを使用して実行されます。

材料

●吸光度検出モード付きモレキュラーデバイス マイクロプレートリーダー：

・SpectraMax ® Plus 384 (cat. #PLUS 384)
・SpectraMax 190 (cat. #190)
・SpectraMax 340PC384 (cat. #340PC 384)
・VersaMax™ (製品番号 VERSAMAX)
・SpectraMax M2/M2 e (カタログ番号 M2 または M2E)
・SpectraMax M5/M5 e (型番: M5 または M5E)
・FlexStation ® 3 (型番: FLEX3)
・SpectraMax i3x (型番: i3x)
・SpectraMax iD3 (商品番号iD3)

●モレキュラーデバイス AquaMax 4000 マイクロプレートウォッシャー（注文に応じて構成します）
●メラミンプレートキット (Beacon Analytical Systems)

方法

• テストを実施する前に、試薬を室温に戻しました。
• メラミン抗体を塗布した適切な数のウェルをマイクロウェルホルダーにセットしました。残りのテストウェルは、付属のジッパー付きバッグに再密封しました。96ウェルすべてを一度に洗浄するAquaMax 4000 マイクロプレートウォッシャーを使用することができます。
• 150µLのキャリブレーション（トリプリケート）または希釈サンプル抽出液を、使い捨てチップ付きピペットを用いて適切な試験ウェルに添加しました。それぞれ清潔なピペットチップを使用しました。
• 各ウェルにメラミン HRP 抱合体を 50μL 添加しました。
• プレートを60秒間軽く振り、室温で30分間インキュベートしました。
• ウェルの内容物を吸引し、250µLの洗浄液（1x PBS/0.05% Tween-20）をAquaMax 4000マイクロプレートウォッシャーを用いて分注し、合計4回の吸引/分注サイクルを行いました。
• 最後の洗浄後、反転したプレートを吸光度ソリューションの上にタッピングし、残存する洗浄液を除去しました。
• 100μLの基質を各ウェルに分注し、プレートを室温で30分間インキュベートしました。
• 100μLの停止液を各テストウェルに分注しました。
• SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用して、VersaMaxマイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定しました。
• キャリブレーションはSoftMax Proソフトウェアを用いてプロットしました。

結果

光学濃度（OD）値を用いてstandard curveを作成しました。キャリブレーターのOD値（y軸）とキャリブレーター濃度の対数（x軸）をプロットしました。検体のメラミン含有量は、standard curveから補間することができました。OD値が最低検量線より大きい試料または最高検量線より小さい試料は、それぞれ<20 ppbまたは>500 ppbとして報告しなければなりません。

図1は、上記のようにプロットしたメラミンstandard curveを4-parameter curve fit処理で示したものです。図2は、semi-log curve fitを用いてプロットしたメラミン標準物質を示しています。通常、4-parameter curveの方が、標準曲線の高値側と低値側でよりよくフィットし、好ましいです。

表1にメラミンプレート・キットのキャリブレーター・データの要約を示します。製品添付文書に概説されているテスト手順と、必要な洗浄ステップにAquaMax® 4000マイクロプレートウォッシャーを使用した場合、5%未満の優れたCVが観察されました。

表1. メラミンプレート・キットのデータサマリー。平均OD、標準偏差、%CVはSoftMax® Proソフトウェアで算出。標準品はトリプリケートで実施しました。

結論

Beacon Analytical Systemsのメラミンプレートキットは、モレキュラーデバイスのSpectraMax、VersaMax、VMax、EMaxマイクロプレートリーダーとともに、牛乳、粉ミルク、ヨーグルト、小麦グルテン、湿潤および乾燥ペットフードなどの食品中のメラミン汚染を検出するための品質保証スクリーニングソリューションをご提供します。モレキュラーデバイスのAquaMax 4000マイクロプレートウォッシャーは、ELISA洗浄ステップの自動化により優れた再現性を実現し、StakMax®マイクロプレートスタッカーと統合してスループットを向上させることができます。また、StakMaxシステムをSpectraMaxおよびVersaMaxマイクロプレートリーダーと組み合わせることで、手作業によるプレートハンドリングを最小限に抑えることができます。完全なデータ解析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準解析ソフトウェアであるSoftMax Pro GxPソフトウェアによって提供されます。

参考文献

1. Melamine Plate Kit Instructional Booklet (Beacon Analytical Systems)

マイクロプレートリーダーについてさらに詳しく >>