Application Note 青色から赤色 蛍光色素に対応した
SpectraMaxマイクロプレートリーダーの蛍光感度

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Krystal Courtney D. Belmonte, PhD | Field Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Christina Nadolny, PhD | Field Applications Scientist II | モレキュラーデバイス

はじめに

蛍光色素の種類によって励起スペクトルと発光スペクトルが異なるため、測定の感度と精度に影響を与える可能性があります。SpectraMaxマイクロプレートリーダーは、波長選択、帯域幅、励起・発光波長ペアのバリエーションなど、装置構成や設定がさまざまであり、さまざまな蛍光色素に対する性能が考慮されています。検出下限(LLD)は、これらの比較において重要なパラメータであり、バックグラウンドノイズから確実に区別できる蛍光色素の最小濃度を表します。

ここでは、リニアレンジやLLDなどの重要なパラメータに焦点を当てながら、青色から赤色の範囲にわたる合計7種類の蛍光色素について、SpectraMaxマイクロプレートリーダーの比較を行います。

100 µMから0.001 pMまでの蛍光色素標準物質を、Tris緩衝生理食塩水(TBS)で連続希釈シリーズとして調製しました。100µLの標準物質を黒の96ウェルマイクロプレート(Greiner;各標準物質についてn=4)のウェルにピペットで注入。100μLのTBSバッファー(n=8)のみを封じ込めたブランクウェルも用意しました。その後、各マイクロプレートリーダーに最適化された設定を用いて蛍光を測定しました(表 9)。Standard curveは、SoftMax® Proソフトウェアを用いてplotしました。各マイクロプレートリーダーの感度を評価するために、各蛍光色素に対するLLD(最小検出限界)は、以下の式を用いて算出しました:

$$\text{LLD} = 3 \, SD_{\text{blank}} \, \frac{\text{concentration}}{(RLU_{\text{sample}} - RLU_{\text{blank}})}$$

装置の比較

  • SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー、TUNEモジュール付き(モレキュラーデバイス P/N 0200-7050)
  • SpectraMax® iD5® マルチモードマイクロプレートリーダー
  • SpectraMax® i3xマルチモードマイクロプレートリーダー
  • SpectraMax® Miniマルチモードマイクロプレートリーダー(フィルターキューブ付、表10参照)
  • SpectraMax® M5eマルチモードマイクロプレートリーダー
  • SpectraMax® Gemini™ EMマイクロプレートリーダー

蛍光色素の比較

  • Alexa Fluor 350 (Molecular Probes)
  • Coumarin B (Thermo Fisher)
  • Fluorescein (Invitrogen)
  • Alexa Fluor 555 (Molecular Probes)
  • Alexa Fluor 594 (Molecular Probes)
  • Alexa Fluor 647 (Invitrogen)
  • Alexa Fluor 750 (Molecular Probes)

図1. Fluorescence SpectraViewer 1 蛍光色素の励起スペクトルと発光スペクトルの比較。

  Alexa Fluor 350 Coumarin B Fluorescein Alexa Fluor 555 Alexa Fluor 594 Alexa Fluor 647 Alexa Fluor 750
SpectraMax Paradigm 13.8 0.81 0.12 1.13 0.60 0.79 26.3
SpectraMax iD5 4.90 2.27 0.35 3.51 0.69 2.6 47.1
SpectraMax i3x 28.6 3.07 0.09 1.23 0.64 0.35 117
SpectraMax Mini 12.7 9.95 0.19 0.94 0.29 0.71 3.50
SpectraMax M5e 3.70 0.74 0.07 1.18 0.46 1.92 67.8
SpectraMax Gemini EM 89.1 7.46 .21 23.9 11.5 29.2 232

表1. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで比較したすべての蛍光色素の検出下限(pM)のまとめ。

Alexa Fluor 350

図2. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 350蛍光色素のstandard curve。

装置 Excitation/ Emission (nM) AF350 LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 360/460 13.8
SpectraMax iD5 360/460 4.90
SpectraMax i3x 360/460 28.6
SpectraMax Mini FL-465* 360/465 12.7
SpectraMax M5e 340/460
Auto Cutoff: 455
3.7
SpectraMax Gemini EM 340/460
Auto Cutoff: 455
89.1

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表2. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるAlexa Fluor 350(AF350)の検出下限値の計算とexcitation/emission。

Coumarin B

図3. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったCoumarin B蛍光色素のstandard curve。

装置 Excitation/ Emission (nM) Coumarin B LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 415/460 0.81
SpectraMax iD5 415/460 2.27
SpectraMax i3x 415/460 3.07
SpectraMax Mini FL-465* 360/465 9.95
SpectraMax M5e 415/460
Auto Cutoff: 455
0.74
SpectraMax Gemini EM 415/460
Auto Cutoff: 455
7.46

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表3. Coumarin Bの検出下限値の算出とSpectraMaxマイクロプレートリーダーに使用されるexcitation/emission

Fluorescein

図4. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったFluorescein蛍光色素standard curve。

設備 Excitation/ Emission (nM) Fluorescein LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 485/530 0.12
SpectraMax iD5 485/535 0.35
SpectraMax i3x 485/535 0.09
SpectraMax Mini FL-535* 485/535 0.19
SpectraMax M5e 485/525
Auto Cutoff: 515
0.07
SpectraMax Gemini EM 485/525
Auto Cutoff: 515
1.21

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表4. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるFluoresceinの検出下限値の計算とexcitation/emission。

Alexa Fluor 555

図5. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 555蛍光体のstandard curve。

装置 Excitation/ Emission (nM) AF555 LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 525/575 1.13
SpectraMax iD5 525/575 3.51
SpectraMax i3x 525/575 1.23
SpectraMax Mini FL-595* 535/595 0.94
SpectraMax M5e 525/575
Auto Cutoff: 570
1.18
SpectraMax Gemini EM 525/575
Auto Cutoff: 570
23.9

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表5. Alexa Fluor 555 (AF555)の検出下限値の計算とexcitation/emission。

Alexa Fluor 594

図6. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 594 蛍光色素 standard curve。

設備 Excitation/ Emission (nM) AF594 LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 545/625 0.60
SpectraMax iD5 545/625 0.69
SpectraMax i3x 545/625 0.64
SpectraMax Mini FL-635* 590/635 0.29
SpectraMax M5e 545/625
Auto Cutoff: 610
0.46
SpectraMax Gemini EM 525/575
Auto Cutoff: 610
11.5

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表6. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるAlexa Fluor 594(AF594)の検出下限値の計算とexcitation/emission。

Alexa Fluor 647

図7. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 647蛍光色素の標準曲線。

装置 Excitation/ Emission (nM) AF647 LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 640/690 0.79
SpectraMax iD5 635/680 2.60
SpectraMax i3x 635/680 0.35
SpectraMax Mini FL-680* 625/680 0.71
SpectraMax M5e 635/680
Auto Cutoff: 665
1.92
SpectraMax Gemini EM 635/680
Auto Cutoff: 665
29.2

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表7. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるAlexa Fluor 647(AF647)の検出下限値の計算とexcitation/emission。

Alexa Fluor 750

図8. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 750蛍光色素の標準曲線。

設備 Excitation/ Emission (nM) AF750 LLD (pM)
SpectraMax Paradigm 740/780 26.3
SpectraMax iD5 740/780 47.1
SpectraMax i3x 740/780 117
SpectraMax Mini FL-810* 710/810 3.5
SpectraMax M5e 740/780
Auto Cutoff: 695
67.8
SpectraMax Gemini EM 740/780
Auto Cutoff: 695
232

*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については表10を参照してください。Alexa Fluor 750 (AF 750)の検出下限値の計算とexcitation/emission。

装置の設定

Parameters SpectraMax Paradigm SpectraMax iD5 SpectraMax i3x SpectraMax Mini SpectraMax M5e SpectraMax Gemini EM
Read mode Fluorescence (FL)
Read type Endpoint
PMT and optics PMT Gain: N/A
Integration time: 200 ms
PMT Gain: Auto
Integration time: 400 ms
PMT Gain: Fixed Flashes per read: 12 PMT Gain: Auto
Integration Time: 500 ms
PMT Gain: Auto
Flashes per read: 100
PMT Gain: Auto
Flashes per read: 12

表9. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用する設定。

SpectraMax Miniフィルターキューブ

フィルターキューブ Wavelength / Bandwidth Part#
FL-465 Excitation: 360/35 Emission: 465/35 Dichroic: 405 5089096
FL-535 Excitation: 485/20 Emission: 535/25 Dichroic: 508 5089097
FL-595 Excitation: 535/25 Emission: 595/35 Dichroic: 560 5089098
FL-635 Excitation: 590/20 Emission: 635/20 Dichroic: 612 5089102
FL-680 Excitation: 625/35 Emission: 680/20 Dichroic: 658 5089103
FL-810 Excitation: 710/50 Emission: 810/40 Dichroic: 765 5089104

表10. SpectraMax Miniマイクロプレートリーダーで使用するフィルターキューブのwavelength構成。

参照

  1. ThermoFisher. Fluorescence SpectraViewer. https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
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