Application Note 青色から赤色 蛍光色素に対応した
SpectraMaxマイクロプレートリーダーの蛍光感度
PDF版(英語)
Krystal Courtney D. Belmonte, PhD | Field Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Christina Nadolny, PhD | Field Applications Scientist II | モレキュラーデバイス
はじめに
蛍光色素の種類によって励起スペクトルと発光スペクトルが異なるため、測定の感度と精度に影響を与える可能性があります。SpectraMaxマイクロプレートリーダーは、波長選択、帯域幅、励起・発光波長ペアのバリエーションなど、装置構成や設定がさまざまであり、さまざまな蛍光色素に対する性能が考慮されています。検出下限(LLD)は、これらの比較において重要なパラメータであり、バックグラウンドノイズから確実に区別できる蛍光色素の最小濃度を表します。
ここでは、リニアレンジやLLDなどの重要なパラメータに焦点を当てながら、青色から赤色の範囲にわたる合計7種類の蛍光色素について、SpectraMaxマイクロプレートリーダーの比較を行います。
100 µMから0.001 pMまでの蛍光色素標準物質を、Tris緩衝生理食塩水(TBS)で連続希釈シリーズとして調製しました。100µLの標準物質を黒の96ウェルマイクロプレート(Greiner;各標準物質についてn=4)のウェルにピペットで注入。100μLのTBSバッファー(n=8)のみを封じ込めたブランクウェルも用意しました。その後、各マイクロプレートリーダーに最適化された設定を用いて蛍光を測定しました(表 9)。Standard curveは、SoftMax® Proソフトウェアを用いてplotしました。各マイクロプレートリーダーの感度を評価するために、各蛍光色素に対するLLD(最小検出限界)は、以下の式を用いて算出しました:
$$\text{LLD} = 3 \, SD_{\text{blank}} \, \frac{\text{concentration}}{(RLU_{\text{sample}} - RLU_{\text{blank}})}$$
装置の比較
- SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー、TUNEモジュール付き(モレキュラーデバイス P/N 0200-7050)
- SpectraMax® iD5® マルチモードマイクロプレートリーダー
- SpectraMax® i3xマルチモードマイクロプレートリーダー
- SpectraMax® Miniマルチモードマイクロプレートリーダー(フィルターキューブ付、表10参照)
- SpectraMax® M5eマルチモードマイクロプレートリーダー
- SpectraMax® Gemini™ EMマイクロプレートリーダー
蛍光色素の比較
- Alexa Fluor 350 (Molecular Probes)
- Coumarin B (Thermo Fisher)
- Fluorescein (Invitrogen)
- Alexa Fluor 555 (Molecular Probes)
- Alexa Fluor 594 (Molecular Probes)
- Alexa Fluor 647 (Invitrogen)
- Alexa Fluor 750 (Molecular Probes)
図1. Fluorescence SpectraViewer 1 蛍光色素の励起スペクトルと発光スペクトルの比較。
Alexa Fluor 350 | Coumarin B | Fluorescein | Alexa Fluor 555 | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 647 | Alexa Fluor 750 | |
---|---|---|---|---|---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 13.8 | 0.81 | 0.12 | 1.13 | 0.60 | 0.79 | 26.3 |
SpectraMax iD5 | 4.90 | 2.27 | 0.35 | 3.51 | 0.69 | 2.6 | 47.1 |
SpectraMax i3x | 28.6 | 3.07 | 0.09 | 1.23 | 0.64 | 0.35 | 117 |
SpectraMax Mini | 12.7 | 9.95 | 0.19 | 0.94 | 0.29 | 0.71 | 3.50 |
SpectraMax M5e | 3.70 | 0.74 | 0.07 | 1.18 | 0.46 | 1.92 | 67.8 |
SpectraMax Gemini EM | 89.1 | 7.46 | .21 | 23.9 | 11.5 | 29.2 | 232 |
表1. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで比較したすべての蛍光色素の検出下限(pM)のまとめ。
Alexa Fluor 350
図2. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 350蛍光色素のstandard curve。
装置 | Excitation/ Emission (nM) | AF350 LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 360/460 | 13.8 |
SpectraMax iD5 | 360/460 | 4.90 |
SpectraMax i3x | 360/460 | 28.6 |
SpectraMax Mini | FL-465* 360/465 | 12.7 |
SpectraMax M5e | 340/460 Auto Cutoff: 455 |
3.7 |
SpectraMax Gemini EM | 340/460 Auto Cutoff: 455 |
89.1 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表2. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるAlexa Fluor 350(AF350)の検出下限値の計算とexcitation/emission。
Coumarin B
図3. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったCoumarin B蛍光色素のstandard curve。
装置 | Excitation/ Emission (nM) | Coumarin B LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 415/460 | 0.81 |
SpectraMax iD5 | 415/460 | 2.27 |
SpectraMax i3x | 415/460 | 3.07 |
SpectraMax Mini | FL-465* 360/465 | 9.95 |
SpectraMax M5e | 415/460 Auto Cutoff: 455 |
0.74 |
SpectraMax Gemini EM | 415/460 Auto Cutoff: 455 |
7.46 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表3. Coumarin Bの検出下限値の算出とSpectraMaxマイクロプレートリーダーに使用されるexcitation/emission
Fluorescein
図4. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったFluorescein蛍光色素standard curve。
設備 | Excitation/ Emission (nM) | Fluorescein LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 485/530 | 0.12 |
SpectraMax iD5 | 485/535 | 0.35 |
SpectraMax i3x | 485/535 | 0.09 |
SpectraMax Mini | FL-535* 485/535 | 0.19 |
SpectraMax M5e | 485/525 Auto Cutoff: 515 |
0.07 |
SpectraMax Gemini EM | 485/525 Auto Cutoff: 515 |
1.21 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表4. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるFluoresceinの検出下限値の計算とexcitation/emission。
Alexa Fluor 555
図5. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 555蛍光体のstandard curve。
装置 | Excitation/ Emission (nM) | AF555 LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 525/575 | 1.13 |
SpectraMax iD5 | 525/575 | 3.51 |
SpectraMax i3x | 525/575 | 1.23 |
SpectraMax Mini | FL-595* 535/595 | 0.94 |
SpectraMax M5e | 525/575 Auto Cutoff: 570 |
1.18 |
SpectraMax Gemini EM | 525/575 Auto Cutoff: 570 |
23.9 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表5. Alexa Fluor 555 (AF555)の検出下限値の計算とexcitation/emission。
Alexa Fluor 594
図6. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 594 蛍光色素 standard curve。
設備 | Excitation/ Emission (nM) | AF594 LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 545/625 | 0.60 |
SpectraMax iD5 | 545/625 | 0.69 |
SpectraMax i3x | 545/625 | 0.64 |
SpectraMax Mini | FL-635* 590/635 | 0.29 |
SpectraMax M5e | 545/625 Auto Cutoff: 610 |
0.46 |
SpectraMax Gemini EM | 525/575 Auto Cutoff: 610 |
11.5 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表6. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるAlexa Fluor 594(AF594)の検出下限値の計算とexcitation/emission。
Alexa Fluor 647
図7. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 647蛍光色素の標準曲線。
装置 | Excitation/ Emission (nM) | AF647 LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 640/690 | 0.79 |
SpectraMax iD5 | 635/680 | 2.60 |
SpectraMax i3x | 635/680 | 0.35 |
SpectraMax Mini | FL-680* 625/680 | 0.71 |
SpectraMax M5e | 635/680 Auto Cutoff: 665 |
1.92 |
SpectraMax Gemini EM | 635/680 Auto Cutoff: 665 |
29.2 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については、表10を参照してください。表7. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用されるAlexa Fluor 647(AF647)の検出下限値の計算とexcitation/emission。
Alexa Fluor 750
図8. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで読み取ったAlexa Fluor 750蛍光色素の標準曲線。
設備 | Excitation/ Emission (nM) | AF750 LLD (pM) |
---|---|---|
SpectraMax Paradigm | 740/780 | 26.3 |
SpectraMax iD5 | 740/780 | 47.1 |
SpectraMax i3x | 740/780 | 117 |
SpectraMax Mini | FL-810* 710/810 | 3.5 |
SpectraMax M5e | 740/780 Auto Cutoff: 695 |
67.8 |
SpectraMax Gemini EM | 740/780 Auto Cutoff: 695 |
232 |
*SpectraMax Miniフィルターキューブの構成については表10を参照してください。Alexa Fluor 750 (AF 750)の検出下限値の計算とexcitation/emission。
装置の設定
Parameters | SpectraMax Paradigm | SpectraMax iD5 | SpectraMax i3x | SpectraMax Mini | SpectraMax M5e | SpectraMax Gemini EM |
---|---|---|---|---|---|---|
Read mode | Fluorescence (FL) | |||||
Read type | Endpoint | |||||
PMT and optics | PMT Gain: N/A Integration time: 200 ms |
PMT Gain: Auto Integration time: 400 ms |
PMT Gain: Fixed Flashes per read: 12 | PMT Gain: Auto Integration Time: 500 ms |
PMT Gain: Auto Flashes per read: 100 |
PMT Gain: Auto Flashes per read: 12 |
表9. SpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用する設定。
SpectraMax Miniフィルターキューブ
フィルターキューブ | Wavelength / Bandwidth | Part# |
---|---|---|
FL-465 | Excitation: 360/35 Emission: 465/35 Dichroic: 405 | 5089096 |
FL-535 | Excitation: 485/20 Emission: 535/25 Dichroic: 508 | 5089097 |
FL-595 | Excitation: 535/25 Emission: 595/35 Dichroic: 560 | 5089098 |
FL-635 | Excitation: 590/20 Emission: 635/20 Dichroic: 612 | 5089102 |
FL-680 | Excitation: 625/35 Emission: 680/20 Dichroic: 658 | 5089103 |
FL-810 | Excitation: 710/50 Emission: 810/40 Dichroic: 765 | 5089104 |
表10. SpectraMax Miniマイクロプレートリーダーで使用するフィルターキューブのwavelength構成。
参照
- ThermoFisher. Fluorescence SpectraViewer. https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
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