Application Note ライフサイエンス研究のカルシウム測定に最適な
FLIPR Calcium 6 Assay Kits

はじめに

モレキュラーデバイスの FLIPR® カルシウム測定キット は、高感度カルシウム指示薬と独自のマスキング染料を採用し、Gタンパク質共役受容体（GPCR）、イオンチャネル、その他カルシウム感受性ターゲットの高感度蛍光スクリーニングを可能にします。新しい染料処方によりカルシウムフラックスアッセイのシグナルウィンドウをさらに拡大し、アッセイの堅牢性を高めるとともに、プロトコールの柔軟性を向上させます。図1に示しますように、FLIPR Calcium 6 Assayのマスキング技術は細胞内に侵入せず、残留する細胞外カルシウム指示薬や培地などの成分に由来するバックグラウンド蛍光を大幅に低減します。FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit（図1参照）はマスキング技術を含まず、消光感受性ターゲットやマルチプレックス用途に対応する新しい柔軟な選択肢を提供します。さらに、アッセイにおけるプロベネシドの使用は最小限、または不要です。一部の細胞（例：CHO細胞株）にはアニオン交換タンパク質が存在し、一般的なカルシウム指示薬を細胞質内に保持するためにプロベネシドなどのアニオン再取り込み阻害剤が必要です。しかし、FLIPR Calcium 6 Assay Kit の独自染料処方は有機アニオントランスポーターに対して高い耐性を示すため、プロベネシドの使用量を減らす、または不要にできます。

FLIPR Calcium 6 および Calcium 6-QF Assayの調製

本研究では FLIPR Calcium 6（製品番号 R8190）および Calcium 6-QF（製品番号 R8192）Explorer Kits を使用しました。両染料は Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）＋20 mM HEPES に溶解しました。必要に応じて、染料の細胞外漏出を防ぐためにプロベネシド（PBX）を添加しました。前日に播種した接着性 CHO M1 細胞を 384 ウェル黒透明プレートからインキュベーターから取り出し、各ウェルに 25 µL の FLIPR Calcium 6、Calcium 6-QF、Calcium 5 Assay Kit の染料、または競合キットの染料ローディングバッファを、25 µL のアッセイバッファまたは培地とともに添加しました。

FLIPR Calcium 6 および Calcium 6-QF キットの場合、染料をロードしたプレートは 37°C、5% CO₂ で 2 時間インキュベートしました。FLIPR Calcium 5 Assay Kit および競合キットは、メーカー推奨プロトコールに従い、37°C、5% CO₂ で 1 時間インキュベートしました。すべてのプレートはインキュベーターから取り出し、FLIPR® Tetra System または FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーで測定する前に室温で 10 分間冷却しました。

FLIPRカルシウム測定キットまたは Fluo-4 Direct Kit を使用したプレートは、染料ロード後の洗浄を必要としませんでした。Fluo-4 染料のみのプレートは HBSS アッセイバッファで 3 回洗浄しました。

FLIPR Tetra System および FlexStation 3 プレートリーダーでのカルシウム動員アッセイ

適切なリガンドの 5 倍濃度溶液を HBSS バッファ＋20 mM HEPES で調製し、384 ウェルポリプロピレンプレートに分注しました。アゴニストは FLIPR Tetra System または FlexStation 3 リーダーで検出中に最適化パラメータで添加しました。シグナルは各ウェルで約 90 秒間、添加中および添加後に相対蛍光単位（RFU）で測定しました。出力はシグナルウィンドウ（Δf/f）の最大値から最小値を差し引いて算出しました。グラフおよび EC₅₀/IC₅₀ 濃度のデータは ScreenWorks® または SoftMax® Pro ソフトウェアからエクスポートし、GraphPad Prism で計算しました。Z 因子の計算は Zhang らの方法に従いました。

結果

FLIPR Calcium 6 Assay Kits と他のカルシウム指示薬の比較は、ATCC 由来 CHO M1WT3 細胞のムスカリン受容体アゴニズムを用いて測定しました（図2）。各アッセイはメーカー指示に従い、最適な染料ロード時間でインキュベートしました。Fluo-4 洗浄（Fluo-4W）アッセイは細胞操作が多く、細胞外蛍光バックグラウンドが大きいため、最も小さいウィンドウを示しました。FLIPR Calcium 6 および Calcium 6-QF キットはそれぞれ Δf/f = 4 および 4.2 の最大シグナルウィンドウを示しました。EC₅₀ 値はすべてのケースで保持され、FLIPR Calcium 6 Kit はアゴニストアッセイで Z @ EC₈₀ = 0.88 を示しました。

アロステリックモジュレーターのスクリーニングには EC₃₀ のリガンド濃度を使用する必要があります。この低濃度で大きなシグナルウィンドウを確保することが重要です。CHO M1WT3 細胞は EC₃₀ 濃度のカルバコールで刺激されました（図3）。FLIPR Calcium 6 Assay Kits のシグナル強度は競合キットの約2倍です。

FLIPR Calcium 6 Assay Kits は幅広い細胞株で使用できます。図4では、内因性ヒスタミン1受容体を発現する「アッセイレディ」凍結細胞 1321N1（ECACC、英国ポートンダウン）を FlexStation 3 リーダーでアッセイしました。FLIPR Calcium 5 Assay Kit、Fluo-4 Direct Kit、FLIPR Calcium 6 Assay Kit、FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit を用いてヒスタミン受容体の応答をヒスタミン濃度の増加に対して比較した結果、FLIPR Calcium 6 Assay Kit が最大のシグナルウィンドウを示しました。SoftMax Pro ソフトウェアで算出された EC₅₀ 値は期待値の半ログ以内でした。

CHO M1 細胞は、Fluo-3 や Fluo-4 など一般的なカルシウム指示薬を保持するためにアニオン再取り込み阻害剤プロベネシドの使用が必要です。FLIPR Calcium 5 Assay Kit の染料も細胞外に排出され、プロベネシドなしでは応答が見られません。FLIPR Calcium 6 Assay Kit の蛍光団は細胞内に保持されやすいよう設計されています。図5は、プロベネシドなしの FLIPR Calcium 6 Assay Kit が小さいシグナルを生成するものの、依然として2倍以上のシグナルウィンドウと EC₈₀ における Z 因子 0.86 を示すことを示しています。EC₅₀ 値は半ログ以内でした。

結論

FLIPR Calcium 6 および Calcium 6-QF Assay Kits は、信頼性の高い薬理学データ、優れたシグナルウィンドウ、高品質なアッセイ性能を提供しながら、柔軟なカルシウムフラックスアッセイオプションを実現します。シグナルウィンドウの拡大は重要です。なぜなら、現在の多くのアッセイは、過剰発現受容体を用いた標準的なアゴニズム／アンタゴニズムアッセイでは見られない課題を提示するからです。内因性受容体を持つ細胞株、受容体発現量の低い細胞、凍結細胞、初代細胞、または幹細胞の使用は、全体的な応答を低下させる可能性があります。FLIPR Calcium 6 Kits が提供する大きなシグナルウィンドウは、これらの困難なターゲットや細胞株を用いた化合物スクリーニングおよび最適化において堅牢なアッセイを実現します。さらに、アロステリックモジュレーターを同定するアッセイを実施する際にも、大きなシグナルウィンドウは利点となります。消光を含まない FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit は、マルチプレックスアッセイや消光感受性ターゲットの研究を可能にする新しい柔軟性を提供します。最後に、CHO 細胞などの細胞株でアニオン再取り込み阻害剤を使用せずにターゲットの挙動を研究できることは有益です。なぜなら、一部の受容体はプロベネシド感受性であり、その使用が自然な生物学的メカニズムを変える可能性があるからです。

以下のモレキュラーデバイス システムと互換性があります。

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