Application Note SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダーと
SpectraMaxインジェクターカートリッジを用いた
デュアルルシフェラーゼレポーター（DLR）アッセイ

はじめに

レポーター遺伝子アッセイは、真核生物遺伝子の発現を研究するために用いられます。デュアルレポーター遺伝子アッセイでは、細胞は2つのベクターでトランスフェクトされます。1つ目は目的の制御プロモーターに結合した実験レポーター遺伝子を含み、2つ目は構成プロモーターに結合したコントロールレポーター遺伝子を含みます。実験レポーターの活性をコントロールレポーターに対して正規化することで、実験のばらつきを最小限に抑えることができます。

ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼを用いた生物発光レポーターシステムは、どちらもアッセイが簡単で感度が非常に高いため、共同レポーターとして広く使用されています。プロメガ社の DLR (Dual-Luciferase® Reporter) アッセイシステムは、ホタルとウミシイタケの両方のルシフェラーゼ活性を一つのマイクロプレートウェルで測定することができ、ホタルは実験レポーターとして、ウミシイタケはコントロールとして機能します。図1は、同じアッセイウェル内で順次起こる2つの酵素反応を示しています *1。この反応にはATP、Mg²⁺、O₂が必要です。ウミシイタケ・ルシフェラーゼは、O₂依存的なコエンテリン・ルシフェリン（コエンテラジン）の酸化反応を触媒するが、Mg²⁺やATPを必要としません *2。 両酵素は基質要求量が異なるので、単一の反応混合物で測定できます。

DLRアッセイでは、異なる基質を含む2つの試薬を別々に送達し、それぞれ発光を読み取る必要があります。このアッセイワークフローは、SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダーとSpectraMaxインジェクターカートリッジを使用して簡単に実行できます *3。 本アプリケーションノートでは、組換え型のホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼにおいて、6桁（デケード）にわたる直線的なダイナミックレンジを示すとともに、1ウェルあたり195〜25,000個のルシフェラーゼ導入細胞の直線的検出が可能であることを実証しています。

材料

• Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)；内容は以下の通り：
  ◦iferase Assay Buffer II
  ◦ルシフェラーゼアッセイ基質
  ◦Stop & Glo Buffer
  ◦Stop & Glo 基質
  ◦5X Passive Lysis Buffer（パッシブ溶解バッファー
• 精製リコンビナントルシフェラーゼ酵素
  ◦ホタルルシフェラーゼ QuantiLum ® Recombinant Luciferase (Promega)
  ◦ウミシイタケルシフェラーゼ 組換えウミシイタケ・ルシフェラーゼ（RayBiotech）
• CHO-K1セル (ATCC)
• コントロールルシフェラーゼベクター
  ◦pGL4.13[luc2/SV40] ホタルルシフェラーゼベクター (Promega)
  ◦pGL4.74[hRluc/TK] ウミシイタケルシフェラーゼベクター (Promega)
• FUGENE HDトランスフェクション試薬 (Promega)
• 6ウェル組織培養プレート (Corning)
• 96ウェルフラットクリアボトム白色TC処理マイクロプレート (Corning)
• BrightMax シーリングフィルム（Genesee）
• 96ウェルおよび384ウェルの白色マイクロプレート（Greiner）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
• SpectraMax インジェクターカートリッジ

方法

酵素標準曲線

ホタルルシフェラーゼのストック溶液は、12.4 mg/mL の溶液を、1 mg/mL の BSA を封入した 1X Passive Lysis Buffer（PLB、Dual-Luciferase Reporter Assay System のコンポーネント）で 1 mg/mL に希釈して調製しました。ストック・ウミシイタケ・ルシフェラーゼは、凍結乾燥した酵素を1X PBSで1mg/mLの濃度に再構成することにより調製しました。

ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの作業溶液（10 µg/mL）は、ストック溶液（1 mg/mL）10 µLを990 µLのPLBに移すことにより作製しました。次に、それぞれのルシフェラーゼ原液10 µLを980 µL PLBに移し、複合ルシフェラーゼ原液標準液（各100 ng/mL）を調製しました。このストックスタンダードを1:10に連続希釈し、100 fg/mL～100 ng/mL（1.6 fM～1.6 nM）の濃度のスタンダードを得ました。Luciferase Assay Reagent II (LAR II) と Stop & Glo Reagent は、Dual-Gloiferase Reporter Assay System テクニカルマニュアルに従って調製しました。

SpectraMax インジェクターカートリッジのインジェクター 1 に LAR II 260μL を、インジェクター 2 に Stop & Glo 試薬 260μL を注入しました。SoftMax ProのAcquisition Viewを使用して、インジェクションによるプレートの読み取りを設定しました（図2）。どちらのインジェクターも、SmartInject Technologyを使用して100µL（96ウェルプレート）または25µL（384ウェルプレート）の試薬を供給するように設定しました。SmartInject Technologyは、試薬を完全に混合するためにプレートの振とうと注入を組み合わせ、2秒間の遅延と10秒間の積分を行います。20μL（96ウェルプレート）または10μL（384ウェルプレート）のルシフェラーゼスタンダードをアッセイウェルにプレーティングしました。アッセイプレートを SpectraMax i3x プレートリーダーのプレート引き出しにプレーティングし、読み取りを開始しました。データ解析とグラフ化はSoftMax Proソフトウェアを用いて行いました。あらかじめ設定されたDual-Luciferase Reporter Assayプロトコルは、SoftMax Proプロトコルライブラリに含まれています。

細胞ベースアッセイ

CHO-K1細胞を6ウェル培養プレートに1ウェルあたり2.5x105細胞でプレーティングし、一晩接着増殖させました。翌日、FUGENE HDトランスフェクション試薬の標準プロトコールに従って、細胞をpGL4.13[luc2/SV40]ホタルルシフェラーゼベクターおよびウミシイタケルシフェラーゼベクターで一過性にトランスフェクトしました。ホタルとウミシイタケのベクターDNAの比率は10:1でした： レニラベクターDNAを使用し、各ウェルに合計1μgのDNAと3μLのFUGENE HDトランスフェクション試薬を投与しました。

トランスフェクションの24時間後、細胞を96ウェル平板クリアボトム白色TC処理マイクロプレートに、1ウェル当たり195～25,000細胞の密度で播種し、一晩増殖させました。その後、1X Passive Lysis Bufferで細胞を溶解し、Dual-Luciferase Reporter Assay SystemとSpectraMax i3xプレートリーダー（インジェクターカートリッジ付き）を用いて、同じプレートでアッセイしました。アッセイに先立ち、発光アッセイシグナルを最大限に検出するため、マイクロプレートの底にソリッド白色プレートシールを貼付しました。

結果

ルシフェラーゼstandard curve

ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼのシグナルは、1.6 fMから1.6 nMまで、テストした酵素の6十 分な範囲にわたって直線的でした（図3）。96ウェルプレートでは、これは1ウェル当たり1fgから1ngに相当し、384ウェルプレートでは0.5fgから0.5ngに相当します。96ウェルと384ウェルのどちらのアッセイフォーマットでも、同様の直線性とダイナミックレンジが得られ、デュアルルシフェラーゼアッセイとSpectraMax i3xシステムがどちらのフォーマットにも適していることが示されました。

細胞ベースアッセイ

ホタルとウミシイタケの両ルシフェラーゼのシグナルは、195～25,000細胞/ウェルという幅広い細胞密度で直線性を示しました（図4）。両酵素間の発光シグナルの大きさの違いは、ホタルの比率が10：1であることによります： 細胞のトランスフェクションに用いたウミシイタケベクターと、SV40（ホタルベクター）とTK（ウミシイタケベクター）のプロモーターの強さが異なるためです。

図5は、ホタルルシフェラーゼのRLU値をウミシイタケ・ルシフェラーゼのRLU値で正規化したものです。正規化された値は、試験された細胞密度の全範囲で同様でした。

結論

上記の結果は、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼについて、1 ウェルあたり 1 fg 未満という優れた感度と、6 デシベルのダイナミックレンジを実証しており、ルシフェラーゼの 発現レベルと細胞密度の広範囲にわたって、ルシフェラーゼシグナルの正確 な測定を保証しています。

SpectraMax i3xプレートリーダーは、冷却光電子増倍管（PMT）を搭載し、発光のバックグラウンドノイズを低く抑えています。SpectraMaxインジェクターカートリッジと組み合わせて使用すると、このシステムは、卓越した感度とダイナミックレンジで、レポーター遺伝子やその他のアッセイを含む豊富なフラッシュタイプの発光アプリケーションを可能にします。解析は、各ルシフェラーゼ値を表示し、結果の解釈を容易にするために正規化された比率を計算する、事前に設定されたSoftMax Proプロトコルを使用して迅速に行われます。

参考文献

1. DeLuca, M.A. and W.D. McElroy (1978) in Meth. Enzymol., 53:3.
2. Matthews, J. C. et al. (1977). Purification and properties of Renilla reniformis luciferase. Biochemistry, 16:58.
3. https://www.promega.com/products/pm/ dlready-luminometers/dlready-validatedluminometers

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