Application Note 複雑な生物学的アッセイを
高感度・高速・高品質にする最新ソリューション

はじめに

Oksana Sirenko, PhD｜シニアリサーチサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Jayne Hesley｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Matt Chan｜光学エンジニア｜モレキュラーデバイス

生物学的研究において、複雑なセルベースの2Dおよび3Dアッセイの利用が増加する中、自動ハイコンテントイメージングの機能改善が強く求められています。ここでは、ImageXpress® Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステムを用いて、アッセイの感度、品質、取得速度の向上を実証します。高出力レーザー光源を使用することで、サンプルへの光の透過量が大幅に増加し、その結果、より明るい画像、感度の向上、アッセイスループットの増加が得られます。この効果は、感度やイメージング時間が制限要因となるアッセイにおいて特に重要です。レーザー光源の実用的な効果を示すため、GPCR活性化アッセイ、がんスフェロイド、肺オルガノイドといった複雑な生物学的アッセイシステムの結果を提示します。

方法

機器

ImageXpress Confocal HT.aiシステムは、405 nmから730 nmの励起範囲をカバーするマルチラインレーザー光源と適合フィルターを搭載しています。この光源は、従来のLED光源と比較して、サンプルへの照射パワーを劇的に増加させます。

以下の例では、ImageXpress Confocal HT.aiシステムと従来のImageXpress Micro Confocalシステムとの比較を行いました。

セルアッセイ

Transfluor®アッセイは、GFPタグ付きβ-arrestinを発現する細胞株を用いて、活性化時に目的の受容体と結合する方法で実施しました *1。細胞はイソプロテレノールで刺激され、濃度依存的に集積した内在化受容体（ピット）が出現しました。これらはFITCチャンネルで20X Plan Apo対物レンズ（60’スピニングディスク）を用いて可視化しました。

HTC116結腸がん細胞株（ATCC）から、Uボトム低接着性（Corning）マイクロプレートを用いて3Dスフェロイドを形成しました *2（Sirenko, 2015）。スフェロイドは抗がん薬で48時間処理後、固定し、DRAQ5、HCS CellMask OrangeまたはAF555 Phalloidin、Whole Cell GreenまたはAF488 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）で染色しました。スフェロイドは20X Plan Apo対物レンズを用いて3D（Zシリーズ、ステップサイズ5 μm）でイメージングしました。細胞解析はMetaXpress®ハイコンテントイメージングソフトウェアで最大投影画像を用いて実施しました。

ヒト肺上皮細胞（ScienCells）から、Matrigel（Corning）ドーム内でStem Cell Technologiesのキットとプロトコール *3を用いて3Dオルガノイドを形成しました。成熟した肺オルガノイド（6週間培養後）は固定し、Hoechst、MitoTracker Orange、AF488 Phalloidinで染色しました。オルガノイドは10X倍率で3D（Zスタック、深さ150–250 μm）イメージングし、MetaXpressの3D画像解析ツールで解析しました。

測定結果

GPCR活性化アッセイ（Transfluor）

Gタンパク質共役型受容体は、創薬ターゲットとして最大のクラスであり、生物学的スクリーニングアッセイで重要な役割を果たします。Transfluorアッセイは、活性化された受容体と結合するGFPタグ付きβ-arrestinの内在化を定量化します。この内在化により、小さな蛍光ピットが出現し、ハイコンテントイメージングでカウント・特徴解析されます。ピットは比較的暗く、LED光源では約1秒の露光が必要です。ImageXpress Confocal HT.aiシステムのレーザー光源では、露光時間を3～4倍短縮し、イメージング時間も33％短縮（アッセイスピード1.5倍向上）しました。さらに、アッセイのZ’値も約20％向上しました。

3Dがんスフェロイド

2つ目のアッセイでは、LED励起を用いた標準イメージングシステムImageXpress Confocalと、レーザー励起を用いたシステムを比較しました。HCT-116スフェロイドはラウンドボトムプレートで4日間培養し、最後の2日間にCytochalasin DまたはNocodazole（各5 μM）で処理しました。スフェロイドは固定後、DRAQ5（核）、Whole Cell Green、Alexa Fluor 555 Phalloidin（アクチン）、またはDRAQ5、HCS CellMask Orange（全細胞）、Alexa Fluor 488 Phalloidin（アクチン）で染色しました。Zシリーズ画像は20X Plan Apo対物レンズを用いて深さ150 μm（ステップサイズ5 μm、31ステップ）で取得しました。画像解析は最大投影画像で核数とスフェロイド面積を算出しました。LEDまたはレーザー励起で取得した画像は14ビットで同等の露光を使用しました。各光源に最適化した露光時間を設定することで、3Dスフェロイドの取得時間はLEDに比べレーザーで約半分に短縮されました（取得チャンネル数や蛍光色素に依存）。

3D肺オルガノイド

肺オルガノイド培養は、一次肺上皮細胞から開始し、Stem Cell Technologiesの試薬とプロトコールを用いてMatrigelドーム内で培養しました。簡単に言うと、細胞はまず2Dで増殖させ、その後、成長因子を減らしたMatrigelと混合し、24ウェルプレートまたはその他のプレートフォーマットのMatrigelドームに播種しました。オルガノイドは疾患モデルや化合物の影響評価に非常に有用なツールです。オルガノイドの自動イメージングと解析は、オルガノイドの表現型変化を定量的に評価し、実験のスループットを向上させるための重要な方法です。共焦点イメージングと3D画像解析は、3D生物学的システムの複雑性を捉えるために特に有用です。

レーザーが3Dオルガノイドサンプルのイメージングに与える影響を評価しました。オルガノイドは複雑な空洞や小胞構造を持つ球状オブジェクトで構成され、10X～40Xの倍率でMatrigelを通して20～30のZプレーンでイメージングしました。オルガノイドは肺組織を損傷することが知られている化合物で処理され、ミトコンドリア、細胞骨格、細胞接着を可視化するマーカーで染色しました。3Dボリューム解析を実施し、オルガノイドおよび内部の細胞をカウント・特徴解析しました。ピクセル強度、解像度、オブジェクトの鮮明度が向上し、より高品質な解析が可能になりました。特に、総露光時間が8倍短縮されたことで、イメージング速度は2.3倍に向上（時間を51～57％短縮）しました。

レーザー光源がアッセイスピードとスループットに与える影響

レーザーがハイコンテントスクリーニングアッセイのスピードとスループットに与える影響を評価するため、5人の研究者による10種類の独立したアッセイで露光時間と取得速度を比較しました。以下のデータは、これら10種類のアッセイで観察された露光時間の短縮とスピード向上（時間短縮）を示しています。

結論

レーザー光源の照射パワーは、画像の輝度とアッセイ感度を大幅に向上させ、特に暗いサンプルで重要です。レーザーを搭載したイメージングシステムは露光時間を大幅に短縮し、その結果、イメージング速度とアッセイスループットが向上しました。3Dイメージングはレーザー光源の恩恵を特に受けました。複数の生物学的アッセイを評価し、画像輝度と品質の向上を実証しました。その結果、アッセイ感度とイメージング速度が向上しました。

1. Transfluor, MolDev https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/dd/img/gpcr-activation-using-metaxpress-acuityxpress-software-and-transfluor-assay-system
2. Sirenko et.al., 2015, Assay and drug development technologies https://www.liebertpub.com/doi/pdfplus/10.1089/adt.2015.655
3. Stem Cell Technologies, https://www.stemcell.com/pneumacult-airway-organoid-kit.html