Application Note エンドトキシンアッセイ対応
SpectraMax吸光プレートリーダー比較

材料

• PYROGENT-5000 カイネティック比濁LALアッセイ（Lonza）
• 96ウェル透明LAL Reagent Grade™マルチウェルプレート（Lonza）
• パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza）
• LAL試薬水（Lonza）
• SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax® Plus 384マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

両方のプレートリーダーは、アッセイのセットアップ前に37ºCに加温しました。

試薬の再構成

• Control Standard Endotoxin（CSE）は、キットに添付された分析証明書に記載されたLAL試薬水（LRW）の量で再構成し、100 EU/mLの溶液を得ました。バイアルは15分間ボルテックスしました。
• LAL試薬は、キットの指示に従ってLAL再構成バッファーで再構成しました。

標準曲線

各プレートリーダーに対して1枚の標準曲線プレートをセットアップしました：

• 10.0 EU/mLのエンドトキシン溶液は、100.0 EU/mLのエンドトキシンストック0.1 mLをLAL試薬水0.9 mLに加えて調製しました。
• 標準曲線用に、10 EU/mL標準から開始し、0.001 EU/mL標準で終了する1:10の希釈系列をLRWで作成しました。
• 各エンドトキシン標準100 μLをLAL試薬グレードのマルチウェルプレートの3連複井に添加しました。
• マイクロプレートは、予熱したプレートリーダー内で37ºCで10分間インキュベートしました。
• 次に、各エンドトキシン標準を含むウェルにLAL試薬100 μLを添加し、SoftMax® Proソフトウェアの事前構成済みのキネティック比色LALプロトコールを使用して、Table 1に示す装置設定で直ちにキネティックリードを開始しました。

表1. SpectraMax ABS PlusおよびSpectraMax Plus 384プレートリーダーでのキネティック濁度測定アッセイの装置設定。SoftMax Proソフトウェアのキネティック比色LALプロトコールには最適な設定が含まれており、結果の解析を自動化します。

均一性試験プレート

• 各プレートリーダーに対して、0.1 EU/mLのエンドトキシンを含む48ウェルを、空のウェルを挟んだチェッカーボードパターンで配置したマイクロプレートをセットアップしました。
• 37ºCで10分間インキュベート後、アッセイウェルにLAL試薬を添加し、Table 1に示す装置設定を使用してキネティックリードを開始しました。

SoftMax ProソフトウェアのData Reductionダイアログで、以下のパラメータを使用しました：

• 最初のデータポイントをゼロに設定
• キネティックリダクション：オンセットタイム（オンセットODを0.03に設定）

平均オンセットタイムはソフトウェアで計算され、エンドトキシン濃度に対してプロットしました。

両プレートリーダーからのエンドトキシンデータの比較

図1は、SpectraMax ABS PlusおよびPlus 384プレートリーダーから得られた標準曲線を示しています。両方の標準曲線のr²値は0.99を超えており、各標準（n = 3）の%CV値は7未満でした。

図1: SpectraMaxプレートリーダーでのエンドトキシン標準曲線（対数-対数カーブフィットを使用してプロット）。SpectraMax ABS Plusプレートリーダーでは r² = 0.996 (n = 3)、SpectraMax Plus 384プレートリーダーでは r² = 0.997 (n = 3) です。

表2は均一性試験の結果をまとめたものです。ここでは、各プレートのCVは3未満であり、2つのプレートリーダーで実施したプレート間の平均オンセットタイムの差はわずか7%でした。

表2. SpectraMaxプレートリーダー間の均一性。0.1 EU/mL標準に対する平均オンセット値の差は、SpectraMax ABS PlusとSpectraMax Plus 384プレートリーダー間で7%でした。

これらの結果から、SpectraMax ABS PlusとSpectraMax Plus 384の両プレートリーダーは同等の結果を提供することが示されています。高い直線性を持つ標準曲線により正確なエンドトキシン定量が可能であり、低いプレート間%CVにより結果の均一性が保証されます。