Application Note エンドトキシンアッセイを用いた
SpectraMax吸光マイクロプレートリーダーの性能比較

材料

• PYROGENT-5000 カイネティック比濁LALアッセイ（Lonza）
• 96ウェル透明LAL Reagent Grade™マルチウェルプレート（Lonza）
• パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza）
• LAL試薬水（Lonza）
• SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax® Plus 384マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

どちらのプレートリーダーもアッセイをセットアップする前に37ºCに加温。

試薬の再構成

• コントロールスタンダードエンドトキシン（CSE）を、キットに同梱の分析証明書に記載された容量のLAL試薬水（LRW）で再構成し、100 EU/mLの溶液を得た。バイアルを15分間ボルテックスしました。
• LAL試薬はキットの説明書に従ってLAL Reconstitution Bufferで再構成。

標準曲線

各プレートリーダーに 1 枚の標準曲線プレートをセット：

• 100.0 EU/mL エンドトキシン原液 0.1 ml を LAL 試薬水 0.9 ml に加え、10.0 EU/ml エンドトキシンを封じ込めた溶液を調製。
• 10EU/mL標準品から始まり0.001EU/mL標準品で終わる1:10希釈系列を標準曲線用にLRWで作製。
• 各エンドトキシン標準物質100 μLをLAL試薬グレードマルチウェルプレートのトリプリケートウェルに添加。
• マイクロプレートを予熱したプレートリーダー内で37℃で10分間インキュベート。
• その後、100 μLのLAL試薬をエンドトキシン標準物質を封入したウェルに添加し、SoftMax® Proソフトウェアの試薬添加と測定のプロトコールを使って、表1に示す装置設定でカイネティック測定を直ちに開始。

表1. SpectraMax ABS PlusおよびSpectraMax Plus 384プレートリーダーでのカイネティック比濁アッセイの設定。SoftMax Proソフトウェアのカイネティック発色LALプロトコルには最適な設定が含まれていて、結果の自動分析が可能です。

均一性試験プレート

• 各プレートリーダーについて、0.1 EU/mLのエンドトキシンを封じ込めた48ウェルのマイクロプレートを、空のウェルを挟んで交互に（チェッカーボード）配置しました。
• 37℃で10分間インキュベートした後、LAL試薬をアッセイウェルに添加し、表1に示す設定を用いてカイネティック測定を開始しました。

SoftMax® ProソフトウェアのData Reductionダイアログを使用して、以下のパラメーターを使用しました：

• 最初のデータポイントをゼロに設定
• カイネティックリダクション： オンセット時間、オンセットODを0.03に設定

平均オンセット時間をソフトウェアで計算し、エンドトキシン濃度に対してプロット。

両プレートリーダーのエンドトキシンデータの比較

図1は、SpectraMax ABS PlusおよびPlus 384プレートリーダーから得られた標準曲線。両標準曲線ともr2値は0.99以上であり、各標準（n = 3）の%CV値は7未満でした。

図1：SpectraMaxマイクロプレートリーダーにおけるエンドトキシン標準曲線（log-logカーブフィットを用いてプロット）。SpectraMax ABS Plusプレートリーダーではr2 = 0.996（n = 3）、SpectraMax Plus 384プレートリーダーではr2 = 0.997（n = 3）。

表2は均一性テストの結果をまとめたものです。ここで、各プレートのCVは3未満であり、2つのプレートリーダーで実行したプレートの平均オンセット時間の差はわずか7％でした。

表2. SpectraMaxマイクロプレートリーダー間の均一性。SpectraMax ABS PlusとSpectraMax Plus 384プレートリーダーの間で、0.1 EU/mL標準の平均オンセット値に7％の差が認められました。

これらの結果は、SpectraMax ABS PlusとSpectraMax Plus 384プレートリーダーの両方が同等の結果をもたらすことを示しています。すなわち、直線性の高い標準曲線は正確なエンドトキシン定量を可能にし、低いプレート間%CVは結果の均一性を保証します。