Application Note 異方性によるビーズ結合の解析
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はじめに
蛍光偏光異方性の測定は、生体分子の局所環境を評価するための強力な手法です。異方性とは、分子が励起されてから蛍光を放出するまでの間にどの程度回転したかを示す指標であり、分子量、結合状態、粘性、励起および蛍光の双極子間の配向、あるいは分子固有の異方性など、さまざまな要因によって影響を受けます。異方性パラメーター\( r \)は、以下の式により算出されます。ここで、\( I_{\parallel} \)は偏光方向に平行な蛍光強度、\( I_{\perp} \)は偏光方向に垂直な蛍光強度を表します：
$$ r = \frac{I_{\parallel} - I_{\perp}}{I_{\parallel} + 2I_{\perp}} $$
蛍光偏光（FP）アッセイは、バルク溶液中で蛍光分子の実効質量の変化を測定するために長年使用されてきました。典型的なアッセイでは、蛍光標識化合物がより大きな分子と結合することで、FPまたは異方性が変化します。ImageXpress® Velos システムは、ビーズや細胞の結合アッセイにおけるオブジェクトベースの異方性測定に加え、従来型のバルク溶液アッセイにも対応しています。
本アプリケーションノートでは、モデル系として、Alexa Fluor™ 488でビオチン標識された蛍光色素（b-AF488、Molecular Probes）、ストレプトアビジン（SA、Prozyme）、およびSAコートされた10 µmポリスチレンビーズ（Spherotech）を用いたビーズ結合アッセイの性能データを紹介します。アッセイはガラス底の384ウェルプレート（Matrical）で実施され、488 nmレーザーでスキャンされました。b-AF488の蛍光は、510–540 nmのバンドパスフィルター（Omega）を通して光電子増倍管（PMT）で検出されました。測定は2チャネルで行われ、1つは励起レーザーに対して平行偏光（Para）、もう1つは垂直偏光（Perp）を収集しました。すべてのデータは、BlueImage解析ソフトウェアおよびMicrosoft Excel™で解析されました。
結果 - バルク溶液での測定
ImageXpress Velos システムのバルク溶液における性能は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のb-AF488の異方性と、PBS中でb-AF488とストレプトアビジン（SA）を混合した2種類の溶液との比較によって評価されました。使用したサンプルは以下の表に示されています。
| サンプル名 | b-AF488 | SA量 |
|---|---|---|
| Dye | 40 µl of 5 nM | なし |
| Dye + 1x SA | 40 µl of 5 nM | 4 µl of 10 µg/m |
| Dye + 5x SA | 40 µl of 5 nM | 4 µl of 50 µg/ml |
図1. PBS溶液中における、遊離状態のb-AF488色素とSAに結合したb-AF488の異方性の比較。
シングルウェルに対して15分間にわたり7回の測定を繰り返しました。PBS中のb-AF488の異方性は内部標準として0.018に設定されました。最初の2種類の溶液における7回の平均異方性\( r \)をプロットしたものが図1です。誤差棒は測定値の標準偏差を示しています。第2および第3の溶液間で変化が見られなかったことから、結合の飽和が示唆されます。予想通り、低分子量の色素が高分子量のSAに結合することで異方性が増加しました。2つの状態間で明確な差異が確認されました。
結果 - ビーズへの結合
b-AF488の異方性に対する結合の影響を示すため、SAでコーティングされたビーズの1:200希釈液を20 µL、1ウェルに分注しました（図2参照）。まず、サンプルをスキャンしてバックグラウンド信号を取得しました。ポリスチレンビーズの自家蛍光が一部観察されました。
図2. 384ウェルプレート内のビーズと色素の画像
その後、10nMのb-AF488を20 µL添加し、10分間にわたり7回の測定を行いました。BlueImageソフトウェアでしきい値処理を行い、ビーズ特有のデータを抽出し、ビーズ集団全体の平均パラメーターを算出しました。視野内で約70個のビーズが測定され、残りのピクセルからパラメーターが計算されました。
図3. PBS溶液中でSAコートビーズにb-AF488が結合する際の蛍光強度の時間経過
ParaおよびPerpチャンネルで測定されたビーズと色素の蛍光強度データが図3に示されています。ビーズの蛍光強度は6〜8分間にわたり徐々に増加し、その後飽和しました。これはb-AF488色素がSAコートビーズに結合したことと一致しています。色素の信号がわずかに減少しているのは、結合によって遊離色素の濃度が低下したためです。必要に応じて結合速度を算出することで、初期色素濃度の評価も可能です。異方性は各時点で計算され、平均値が図4に示されています。結合した色素の異方性は内部標準として0.18、PBS中の遊離色素は0.018に設定されました。ビーズデータの誤差棒は、各時点におけるビーズ集団の平均の標準偏差を示しています。
図4. SAコートビーズに結合したb-AF488（Bead）とPBS中の遊離b-AF488色素（Dye）の蛍光異方性。図2に示された時間経過に基づいて取得されたデータ
結合した色素の異方性は時間経過にわたり非常に安定しており、結合した蛍光分子の微小環境が変化しなかったことを示しています。ImageXpress Velos システムの性能評価のため、384ウェルプレート全体で個別ウェルのビーズ異方性を測定しました。各ウェルで約100個のビーズが解析され、平均異方性値が算出されました。
図5. ImageXpress Velos システムによるプレート全体の異方性ばらつき。プレート全体の変動係数（CV）は1.5%と優れた結果が得られました
結論
これらの結果は、ImageXpress Velos システムがバルク溶液中の異方性変化だけでなく、対象物ごとの異方性も測定可能であることを示しています。本プラットフォームにより、異方性変化に基づくアッセイの実施が可能となります。さらに、異方性は、従来の蛍光強度アッセイの堅牢性を高めるためのゲーティングパラメーターとしても活用できます。ImageXpress Velos システムは、時間経過に伴う測定にも対応しており、反応速度の解析にも利用可能です。現在、細胞の異方性測定も開発中であり、膜結合や細胞内移行、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いたアッセイへの応用が期待されています。本プラットフォームの独自の光学系とスキャンエンジンにより、学術研究からバイオテクノロジー分野のスクリーニングまで、幅広いニーズに対応するシンプルな「プラグ＆プレイ」型のアプリケーションが実現されています。
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