Application Note CRISPRベースの細胞株開発ワークフローの自動化

はじめに

Prathyushakrishna Macha, PhD｜研究員｜モレキュラー・デバイス

製薬業界では、ハイスループットな細胞株開発とより良いスクリーニングに対する要求が高まっており、研究施設や企業は既存のラボの自動化を進めています。ロボット工学は約40年前から一部のラボで導入されていたが、現在ではより一般的になり、離席時間を増やすことで研究者を反復作業から解放するのに役立っています。単純なアッセイから複雑なアッセイまで自動化することで、サンプルハンドリング、遠心分離、ラックへの移動、リキッドハンドリングといった熟練を要しないステップの作業負荷を軽減することができます。ロボット工学の新たなトレンドにより、私たちは、より優れた、より小型の、そしてプログラムしやすいロボットを手に入れ、統合ロボット工学ソリューションに簡単に組み込むことができるようになりました *1,*2。

一般的な細胞株開発では、何万ものクローンをスクリーニングして、多量の生物産物を産生する最良の安定細胞を見つける必要があります。ここでは、哺乳類細胞株開発ワークフローの自動化-トランスフェクションされた細胞の編集、モノクロナリティ、増殖評価のための自動化された統合スクリーニング-について述べます（図1）。このシステムには、シングルセル分注装置からモノクローナル細胞のスクリーニング、更なるバリデーションアッセイのための展開まで、全てのステップを実行する複数の機器と協働ロボットが含まれています。この統合システムは、低スループットから高スループットへとスループットを向上させるだけでなく、一貫性を高めることで人為的ミスを排除します。細胞は可能な限り最良の状態に維持され、週末も監視されるため、生産期間が大幅に短縮され、より迅速なスケーラビリティが可能になります。この自動ワークセル・ソリューションには、図1のすべての機器が含まれています。さらに、アッセイの要件や複雑さに応じて、他の機器を簡単に追加することもできます *3,*6。

ケーススタディ

CRISPR編集細胞株のモノクロナリティの自動スクリーニング

この統合システムには、単一細胞プリンター、Clone Select Imager – Florescence (CSI-FL)、リキッドハンドラー、自動インキュベーター、プレートホテル、バーコードリーダー、およびロボットなどが含まれていました。このシステムを用いて、トランスフェクトされた細胞は96ウェルプレートと384ウェルプレートにプリントされ、0日目のモノクロナリティ評価のためにイメージングされ、成長のために定期的にモニターされました。これらのツールを用いた複雑なワークフローは、遺伝子編集アッセイのスループットと自動化を向上させ、細胞のモノクロナリティをスクリーニングし、エンドポイントアッセイを実行しました。このソリューションはセルだけでなく、様々な用途のCRISPR編集オルガノイドの開発にも応用できます（図1）

ラボオートメーション・スケジューリングソフトウェア（GBG、図2）を用いて、機器操作を事前にスケジュールし、ワークフローのステップを実行しました。細胞のCRISPR編集とメンテナンスは、リキッドハンドラーとインキュベーターを用いて行いました。その後、これらの細胞はモノクローナル細胞株の樹立のために、シングルセルずつマルチウェルプレートに分注されました。これらのマルチウェルプレートを0日目にイメージングし、その後CSI-FLを用いて14日目までイメージングし（図3および図4）、0日目のモノクローナリティ保証レポート（図1）を作成し、すべての細胞の成長をモニターしました。細胞は電子的に追跡され、モニタリングパラメーターはプレーティングデータに保存されました：細胞のコンフルエンス、細胞数の推定値、成長曲線。この機器は、CHO、HEK、ハイブリドーマ、IPSCなど、多様な細胞種を含む接着細胞や沈降懸濁細胞タイプに対応し、客観的かつ定量的に細胞増殖を評価します。ここでは、p53 KO用のCRISPRプラスミド（Santa Cruz Bio）を用いて、トランスフェクションによる接着性モノクローナルHEK-293細胞株を開発しました。この細胞株はさらに、編集検証のためのエンドポイントアッセイに供されました［引用アプリ注：7-9参照］。

まとめ

自動化された機器とCSI-FLにより、編集された細胞は、非常に簡単に、数週間の離席時間で、モノクロナリティのイメージングと追跡ができるようになりました。スループット、信頼性、コンタミネーションの可能性は劇的に変化しました。高品質のCRISPR編集細胞株が得られ、エンドポイントアッセイに使用されました。細胞株開発のタイムライン短縮と自動化ソリューションへの需要がますます高まる中、当社はCSI-FLによる自動化統合システムワークフローをご提供しています。

参考文献

1. Lindgren, Kristina, et al. “Automation of cell line development.” Cytotechnology 59.1 (2009): 1-10
2. F. Mirasol, “The Role of Automation in Cell-Line Development,” BioPharm International 32 (1) 2019.
3. Felder, RA, Boyd, JC, Savory, J, Margrey, K, Martinez, A, Vaughn, D. Robotics in the clinical laboratory. Rev Clin Lab Med 1988; 8:699–711. https://doi.org/10.1016/s0272-2712(18)30657-7.Search in Google Scholar
4. Wheeler, MJ. Overview on robotics in the laboratory. Ann Clin Biochem 2007; 44:209–18. https://doi.org/10.1258/000456307780480873.Search in Google Scholar
5. Lippi, G, Da Rin, G. Advantages, and limitations of total laboratory automation: a personal overview. Clin Chem Lab Med 2019; 57:802–11. https://doi.org/10.1515/cclm-2018-1323.Search in Google Scholar
6. Chapman, T. Lab automation and robotics: Automation on the move. Nature 421, 661–663 (2003). https://doi.org/10.1038/421661a
7. Accelerating gene edited cell lines with the CloneSelect Imager FL, Molecular Devices.
8. CloneSelect Imager FL fluorescent imaging for rapid day zero monoclonality assurance, Molecular Devices.
9. What is Gene Editing, CRISPR Engineering, CRISPR/Cas9 | Molecular Devices

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