Application Note 自動カラー計測によるコロニー選別：
QPix 400シリーズによるブルー・ホワイトスクリーニング
- 白色光による形質転換効率の効果的なモニタリング
- 白・青・淡青色コロニーの正確かつ堅牢な色識別
- 自動およびユーザー定義によるインテリジェントなコロニー選別ソフトウェア
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はじめに
組換え遺伝子を含むプラスミドを導入した形質転換細菌のスクリーニングは、分子クローニングにおいて不可欠なステップです。色素反応を利用したレポーター法である「ブルー・ホワイトスクリーニング」は、コロニーの色に基づいて組換え体と非組換え体を容易に識別することができます。ブルー・ホワイトスクリーニングは、組換え形質転換コロニーの視覚的な識別を可能にしますが、コロニーピッキングの多くの手作業は主観的で、時間がかかり、エラーが発生しやすいという課題があります。
モレキュラーデバイスのQPix™ 400シリーズ微生物コロニーピッカーは、白色光イメージングによるブルー・ホワイト色素反応スクリーニングに特化した自動化ソリューションを提供し、形質転換効率の効果的なモニタリングを可能にします。本ソリューションには、QPix™ Software 2.0のBlue-White Pickingモジュール、光学式QPix™ Chroma Filters、および調整可能なソースプレートホルダーが含まれています。
本アプリケーションハイライトでは、QPix™ 420システムを用いた色素反応コロニースクリーニングの概念実証実験の結果をご紹介します。ピッキングされたコロニーの正確性は、DNAシーケンシングによってさらに検証されました。
ブルー・ホワイトスクリーニングの原理
ブルー・ホワイトコロニースクリーニングの分子機構は、LacZレポーター遺伝子に基づいています。この技術では、培地にX-galを含む条件下で、機能性LacZ遺伝子を有する非組換えコロニーは、β-ガラクトシダーゼを発現し、青色に変化します。一方、目的遺伝子の挿入によってLacZ遺伝子が破壊された組換えコロニーは、白色になります（図1参照）。
図1. 分子クローニング ブルー・ホワイトスクリーニング手法の一般的な流れを模式的に示しています。細菌コロニーのブルー・ホワイトスクリーニングでは、抗生物質耐性遺伝子およびLacZレポーター遺伝子を含むプラスミドベクターに目的遺伝子をクローニングします。ベクターのマルチクローニング部位（MCS）に目的遺伝子がライゲーションされることで、LacZ遺伝子が不活性化されます。X-galを含む培地中で形質転換されたコンピテントな**大腸菌（E. coli）**を培養すると、青色および白色のコロニーが形成されます。
目的遺伝子を用いたコロニーへの分子クローニングの応用
モデル構築のために、ヒトインスリン様成長因子（IGF）遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子およびLacZ遺伝子を含むpUC57-Kanクローニングプラスミドベクターのマルチクローニング部位（MCS）にクローニングしました（図2A）。ライフテクノロジーズ社の化学的に形質転換可能な**大腸菌（One Shot® TOP10）**に、ライゲーションされたベクターとヒトIGF遺伝子の混合物を形質転換しました。形質転換後の細菌は、カナマイシン、IPTG、およびX-galを含むLB培地に播種し、37°Cで一晩培養しました。QPix™ 420システムを用いて、目的遺伝子が挿入されたベクターを含むコロニー（白色）と、挿入されていないベクターを含むコロニー（青色）を識別しました（図2B）。
図2. ヒトIGFのpUC57-Kanクローニングプラスミドベクターへのクローニングとブルー・ホワイトコロニースクリーニング (A) ヒトIGF遺伝子（インサート）は、pUC57-Kanクローニングプラスミドベクターのマルチクローニング部位（MCS）にライゲーションされました。(B) LacZレポーター遺伝子に基づく遺伝子発現により、X-galを含むLB培地上に青色および白色のコロニーが形成され、ブルー・ホワイトコロニースクリーニングが可能となります。
調整可能なソースプレートホルダーを用いたコロニーの撮像 細菌コロニーを含むペトリプレートは、調整可能なソースプレートホルダーに保持され、QPix™ Chroma Filterを備えた撮像ベッド上に配置されました（図3A）。ペトリプレートは、プレートホルダーの調整可能なラッチによってしっかりと固定されました（図3B）。その後、白色光を用いて撮像が行われました（図3C）。
図3. QPixシステムを用いたブルー・ホワイトコロニースクリーニング(A) 色の識別精度を高めるために、光学式QPix™ Chroma Filterを使用しています。 (B) プラスチック製品への柔軟な対応を可能にする調整可能なソースプレートホルダーを採用しています。(C) 白色光下で撮像されたコロニーは、QPixソフトウェアによってさらに解析されます。
青色および白色コロニーの自動選択
QPix™ 420システムで取得された白色光画像は、使いやすいQPix™ Software 2.0を用いて解析されました。青色コロニー（図4A）および白色コロニー（図4B）は、内蔵のAuto Select機能によってそれぞれ自動的に識別・選択されました（図4C）。ユーザーは、ヒストグラムのしきい値や、コロニーの選択基準（コンパクトさ、軸比、直径、近接度など）を手動で調整することで、選択精度を最適化することができます。選択された青色および白色コロニーは、QPix™ 420システムに搭載された全空気圧式96ピンピッキングヘッドによってロボットでピッキングされました。
図4. QPixシステムによる青色および白色コロニーの自動選択 (A) Auto Select Blue機能で選択された青色コロニーの例は、青色の矢印で示されています。(B) Auto Select White機能で選択された白色コロニーの例は、白色の矢印で示されています。(C) ソフトウェアの柔軟性により、強い青色コロニーなどを選択するために、輝度のしきい値を手動で調整して結果を最適化することが可能です。
ピッキングされたコロニーのDNA配列確認
青色および白色コロニーの色素反応による選択とピッキングの正確性は、挿入遺伝子の有無を確認するためにDNAシーケンシングによって検証されました。ローリングサークル増幅法により、ピッキングされた白色コロニーの98%が、pUC57-Kanクローニングプラスミドベクター内にヒトIGF遺伝子インサートを含んでいることが確認されました。さらに、ピッキングされた青色コロニーの100%が、目的遺伝子が挿入されていない空のpUC57-Kanクローニングベクターを保持していることが確認されました。これらの実験結果は、モレキュラーデバイスのQPix™ 400シリーズ微生物コロニーピッカーによる白色および青色コロニーの色識別と選択の信頼性を強く裏付けるものです。
まとめ
ブルー・ホワイトコロニースクリーニングは、分子クローニングの結果として目的遺伝子を保持する組換え形質転換コロニーを容易に識別できる色素反応検出法です。モレキュラーデバイスは、QPix 400シリーズ微生物コロニーピッカーに対応したブルー・ホワイトスクリーニング専用の自動化ソリューションを提供しています。QPix Software 2.0の使いやすいソフトウェアインターフェースと光学フィルターにより、白色光下での正確かつ高精度な色識別が可能です。調整可能なラッチ付きプレートホルダーなどのアクセサリーは、プラスチック製品への柔軟な対応をさらに向上させます。QPix 400シリーズは、従来の手動による色識別ベースのコロニースクリーニングに代わる、非常に効率的かつ信頼性の高い選択肢を提供します。
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