Application Note SpectraMax i3マルチモードマイクロプレートリーダーと
SpectraMax MiniMax 300イメージングサイトメーターによる
ミトコンドリア毒性評価

はじめに

薬物スクリーニング計画において重要なことは、ミトコンドリアの健康状態に対する候補薬剤の影響をモニターすることです。ミトコンドリア活性は、様々な色の蛍光色素を用いて容易に分析できます。これらはしばしばDAPIのような核カウンターステインと併用され、画像中のすべての細胞の同定を可能にします。イメージングシステムの1つの蛍光チャンネルで核染色により細胞が同定されると、ミトコンドリア活性は、使用された特異性ミトコンドリア色素に対応する2番目のチャンネルの蛍光として、細胞ごとに測定することができます。しかし、核の対比染色は、実験ワークフローに一連の面倒なステップを追加し、結果を遅らせます。モレキュラーデバイスのStainFree™ テクノロジーは、SpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーターの透過光チャンネルでイメージングした細胞を識別することで、研究者を核染色の煩わしさから解放します。

このアプリケーションのハイライトでは、SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、細胞イメージングでミトコンドリア毒性を評価する方法をご紹介します。イオノフォア抗生物質であるバリノマイシンを用いてPC12細胞のミトコンドリア機能を破壊し、MitoTracker Deep Red FMを用いてその影響をモニタリングしました。細胞を同定するためにStainFreeと蛍光核色素を用いた解析を比較し、SoftMax® Proソフトウェアを用いて結果を評価しました。SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターとSoftMax Proソフトウェアは、毒性の可能性のある化合物に反応したミトコンドリア活性を迅速に定量するための画像取得と解析のための完全なソリューションをご提供します。

細胞ベースアッセイの設定

PC12ラット褐色細胞腫細胞を、2.5％ウシ胎児血清、15％ウマ血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したF-12K培地で培養しました。黒壁透明底96ウェルプレートに、細胞10,000個／ウェル、100μLずつ播種した。細胞は一晩接着させ、増殖させました。

播種の翌日、バリノマイシンを1μMから1nMまで1：2希釈系列でマイクロプレート中の細胞に添加しました。プレーティングは37℃で24時間行いました。化合物のインキュベーション終了後、ウェル内の培養液と化合物を、培養液で希釈したMitoTracker Deep Red FM（MTDR）の100 nM溶液で置換しました。この試薬は生細胞中の活性ミトコンドリアを標識し、MiniMax サイトメーターの赤色蛍光チャンネルで検出される遠赤色波長で蛍光を発します。

細胞を30分間インキュベートした後、染色を除去しました。その後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定しました。固定した細胞の核をEarlyTox Dead Green Dye（モレキュラーデバイス、商品番号R8216）でカウンター染色しました。固定は StainFree 分析には必要ないですが、比較のために本実験の全細胞に対して行いました。細胞はMiniMaxサイトメーターの透過光（TL）チャンネルでイメージングし、細胞数の測定と形態の評価を行い、赤色蛍光チャンネルではミトコンドリア活性を測定しました。また、個々の細胞の核を同定し、StainFree細胞数と並行して比較解析を行うために、緑色チャンネルで細胞をイメージングしました。

SoftMax® Proソフトウェアを用いて、2つの異なる画像解析をセットアップしました。1つ目では、蛍光核染色を必要とせずに透過光画像から個々の細胞を同定できるStainFree解析を用いて、個々の細胞を同定しました。同定された各細胞について、ミトコンドリア染色を表す赤色蛍光シグナルが測定され、ソフトウェアの出力パラメータとして取り込まれました。

StainFreeで得られた結果が核染色で得られた結果と同等であることを確認するために、2つ目の解析が行われました。ここでは、蛍光染色した細胞核を緑色蛍光イメージ チャンネルで同定しました。その結果、核識別マスクにはミトコンドリア蛍光染色が起こる細胞質領域が含まれないため、マスクを4ピクセル（7.5μm）外側に拡張または「成長」させました。これにより、赤色ミトコンドリア蛍光を定量化し、核周辺の細胞質領域についてソフトウェアで報告することが可能になりました。

各分析ケースについて、化合物処理に対するミトコンドリア反応は、細胞あたりの平均ミトコンドリア蛍光対化合物濃度としてグラフ化され、IC₅₀値はソフトウェアによって自動的に計算されました。

結果

PC12細胞は、バリノマイシンで処理した場合、濃度依存的にミトコンドリア標識の減少を示しました。核蛍光色素を用いた画像解析でも、個々の細胞を同定するためのStainFreeテクノロジーを用いた画像解析でも、蛍光ミトコンドリア染色は細胞単位で定量することができ、化合物処理に対するミトコンドリア反応を評価するために用いることができました。図1では、細胞の同定にStainFree解析が用いられています。紫色のマスクは個々の細胞を示します。

図1. PC12細胞のStainFree解析

図2は、個々の細胞を同定するために緑色蛍光染色した核を用いた解析です。この場合、紫色のマスクが核を示します。細胞あたりのミトコンドリア反応を解析するため、マスクはさらに4ピクセル拡大されています。マスクの周りの薄い境界線は、この拡張領域を示し、そのサイズはユーザーが定義できます。

図2. PC12細胞の蛍光分析

どちらの解析方法を用いても、得られるIC₅₀値は同じです（図3）。StainFree解析は、時間と費用のかかる核のカウンター染色に代わる便利な方法です。

図3. バリノマイシンで処理したPC12細胞のIC₅₀曲線

結論

ミトコンドリア色素のような蛍光細胞マーカーを細胞単位で定量する必要がある場合、まず個々の細胞を同定する必要があります。その後、各細胞に関連する蛍光マーカーシグナルを定量することができます。個々の細胞を同定する方法は様々です。一つは細胞の核を蛍光色素で標識する方法ですが、これには細胞の固定が必要な場合があります。より迅速で、より安価で、より毒性の低い方法は、固定や色素を必要としないStainFree Technologyを使用することです。

このアプリケーションのハイライトでは、StainFreeテクノロジーとSpectraMax MiniMax® 300イメージングサイトメーターを使用して、まず個々の細胞を同定し、さらに化合物処理によって強度が変化するミトコンドリアマーカー染色を分析できることを示しました。その結果得られる濃度反応曲線は、核色素を使用して得られるものとほぼ同じである。StainFree テクノロジーは、DAPI のような核カウンターステインを必要とせず、固定されていない細胞に対して分析を行うことを可能にします。これにより、結果が出るまでの時間が短縮され、追加実験のために細胞を生かしておくことができます、より汎用性の高いワークフローが可能になります。

以下のモレキュラーデバイス システムと互換性があります

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