Application Note SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーでの
カルシウム動員アッセイを可能にする
最適化ワークフローの開発

はじめに

Mark McPate PhD｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Simon Lydford｜アプリケーション・サイエンティスト・マネージャー｜モレキュラーデバイス

進行中の研究ニーズに応じて研究室の要件が変化することが多いため、吸光度、発光、蛍光など複数の検出モードを提供するマルチモードマイクロプレートリーダーが必要不可欠。アップグレードが容易なリーダーを持つことも重要です。例えば、細胞ベースのアッセイを容易に実行するための分注オプションを提供することで、柔軟性、コスト削減、ベンチスペースの削減が保証され、複数の専用装置を購入する必要がなくなります。

生化学的アッセイから細胞ベースのアッセイへの移行に関心を持つ研究者は、通常、各プレートからできるだけ多くの情報を引き出したいと考えています。一般的な例としては、GPCRを介したカルシウムシグナルの速度論的検出やイオンチャネル活性が挙げられます。通常、これらのアッセイでは、シグナルは数秒で最大値に達し、減衰するため、化合物の注入と同時にリアルタイムでモニターする必要があります。

ここでは、デュアルインジェクターシステムを搭載したSpectraMax® iD3およびiD5マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、細胞内カルシウムの変化をモニターする情報量の多い蛍光ベースのアッセイを開発する方法を示します。さらに、洗浄不要のFLIPR® Calcium 6および6-QFアッセイキットを使用することで、アッセイシグナルウィンドウが拡大し、アッセイの堅牢性が向上し、接着細胞および浮遊細胞の両方で作業するために必要な柔軟性が得られます。

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーで2つのアッセイを開発し、業界標準のFlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーで行った同じアッセイと比較しました。最初に、FLIPR Calcium 6 キットを用いて、ヒト星細胞腫細胞株 1321N1 のムスカリン性アセチルコリン受容体を調べるための接着細胞アッセイを確立。次に、ヒト単球懸濁細胞株であるTHP-1細胞に着目し、FLIPR Calcium 6-QF Assay Kitを用いてプリン作動性P2Y受容体の研究を可能にするシンプルなワークフローを開発しました。

材料

試薬

• 1321N1細胞 (ECACC)
  ⚪︎培地 DMEM＋2mMグルタミン＋10％ウシ胎児血清（FBS）
• THP 1細胞（ECACC）
  ⚪︎培養培地： RPMI 1640 + 2mM グルタミン + 10%ウシ胎児血清 (FBS)
• カルシウムとマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich）
• 塩化カルバモイルコリン（Sigma-Aldrich）
• 塩化アセチルコリン（Sigma-Aldrich）
• アトロピン（Sigma-Aldrich）
• ピレンゼピン二塩酸塩（Sigma-Aldrich）
• アデノシン5′-三リン酸（ATP）二ナトリウム塩（Sigma-Aldrich）
• ウリジン5′-三リン酸（UTP）二ナトリウム塩（Sigma）
• プロベネシド（AAT Bioquest）
• FLIPR Calcium 6 Assay Kit（モレキュラーデバイス）
• FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit（モレキュラーデバイス）

装置

• SpectraMax iD3およびiD5マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
  ⚪︎SpectraMax インジェクターカートリッジ（モレキュラーデバイス）
• FlexStation 3マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
  ⚪︎8チャンネルピペッターヘッドキット（モレキュラーデバイス）

マイクロプレート

• CellBIND 96 ウェル黒色壁、透明底プレート、滅菌済み (Corning)
• Greiner 96-ウェルプレート、丸底透明ウェル、無菌 (Greiner)

方法

細胞調製

1321N1 "アッセイレディ"凍結細胞を急速解凍し、96ウェル黒壁透明底プレートに、200μLの補充DMEM培地中で、1ウェル当たり2×104細胞ずつ播種。37℃、湿度95％、CO₂ 5％で一晩培養しました。

THP-1細胞は、37℃、95％湿度、5％CO₂のRPMI培地中で懸濁培養。使用当日、各アッセイに必要な細胞数を50mL遠心チューブに分注し、1,000rpmで5分間スピンダウンしました。

色素負荷

1321N1細胞の場合、培地を除去し、200μLのFLIPR Calcium 6試薬（プロベネシド含有）を各ウェルに添加。その後、プレートを37℃、5% CO₂で1時間45分間インキュベートし、その後室温で15分間インキュベートしました。

THP 1細胞については、遠心後、細胞をFLIPRカルシウム6-QF試薬（プロベネシドを含む）に1.25 x 106 cells/mLで再懸濁。Calcium-QF試薬はマスキング色素を使用しないため、ウェル底部の単層ではなく、真の懸濁状態にある細胞のアッセイに理想的です（図1）。細胞を37℃で2時間、振盪水浴中でインキュベートし、アッセイ2分前に180μLの細胞懸濁液を各マイクロプレートウェルに分注しました。

アッセイプロトコル

アゴニスト濃度反応曲線は、SmartInject™ テクノロジー搭載 SpectraMax インジェクターシステムを搭載した SpectraMax iD3 または iD5 プレートリーダーで、一度に 1 濃度のアゴニストを測定しました。各濃度反応曲線について、キャリーオーバーを最小にするため、アッセイを低濃度から高濃度へと実行。インジェクターは化合物でプライムされ、次に色素担持細胞プレートが装置にセットされ、各濃度について3重ウェルを用いてアッセイが実行されました。1321N1 細胞では、SmartInject™ テクノロジーを使用して各ウェルに 5 倍濃縮化合物を 50μL 注入しました。設定、図2をご参照ください。

THP-1細胞では、FLIPR Calcium 6-QF試薬中の細胞180 μLをマイクロプレートの3ウェルにピペッティングし、1321N1細胞の化合物添加と同様のプロトコルを用いたが、注入アーチファクトを最小限に抑えるため、10Xアゴニストの添加量を20 μLと少なめにしました。その後、インジェクターを逆回転させてラインから化合物を除去し、次の高濃度の化合物でプライムしました。新しいプレートセクションを作製し、次の3連ウェルセットでアッセイを実施しました（図3）。

このプロセスを化合物濃度ごとに繰り返した。装置とインジェクターの設定を定義するために、SoftMax Pro 7.1 ソフトウェアの Acquisition Plan Editor を使用（図 2）。

アンタゴニスト試験（1321N1 細胞のみ）のために、細胞培養培地を除去し、ウェルあたり 180 μL の FLIPR Calcium 6  Assay Kitで置換。細胞を37℃で105分間インキュベートした後、20μLの10倍濃縮アンタゴニストを添加し、さらに室温で15分間平衡化しました。次にアゴニスト（5倍濃縮）を、インジェクター1またはインジェクター2を用いて、あらかじめ決められたEC₈₀濃度で50μLずつ3回に分けて添加しました。

FlexStation 3プレートリーダーでも同様の色素負荷とアンタゴニ ストのインキュベーションプロトコールが用いられましたが、 内蔵の8チャンネルピペッターを用い、コンパウンドプレートか ら全7濃度のアゴニストとバッファーコントロールをセ ルプレートのカラムの各ウェルに同時に、あるいはアンタゴニスト研究ではアゴニストのEC₈₀濃度を8反復して供給しました。

結果

デュアルインジェクターにアップグレードしたSpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーを用いることで、接着細胞株と浮遊細胞株の両方において、確実なアゴニストおよびアンタゴニストの濃度反応曲線が得られました。固着細胞 1321N1 の速度論的データは、ミディアムスループットの FlexStation 3 プレートリーダーおよびハイスループットの FLIPR® Penta ハイスループットセルベーススクリーニングシステムで得られたデータと一致しており、3つのシス テムすべてで同様の最大応答が得られました（図 4）。懸濁状態のTHP-1細胞を用いた場合にも同様の状況がみられました（図6）。

接着した1321N1細胞では、細胞外のバックグラウンドを低減する新しいマスキング技術を搭載したFLIPR Calcium 6 Assay Kitを使用した。ムスカリン受容体リガンドであるアセチルコリン、カルバコール、アトロピン、ピレンゼピンに対する反応を測定。アゴニストEC₅₀値とアンタゴニストIC₅₀値の算出には、SoftMax Proソフトウェアに組み込まれた4パラメータのロジスティックカーブフィットとカスタムデータ削減を用いました（図5）。

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーで得られたEC₅₀お よびIC₅₀の計算値を、FlexStation 3プレートリーダーおよび FLIPR Pentaシステムで得られた同等のデータとともに表 1に示します。3つの装置すべてに有意差は認められなかったです。

表1. カルシウム6色素を負荷した1321N1細胞から得られたアゴニストとアンタゴニストのデータ。すべてのデータはμM単位で、n≧3の独立実験。ただし、*のラベルが付いたデータはn＝2である。FLIPR Pentaシステムのデータは、以前の研究で作成されたものです。

これまでは、浮遊細胞の場合、マイクロプレートの底に色素を負荷した細胞の単層を作り、次にリガンドを穏やかに加えて、細胞層に悪影響を与えることなくカルシウム反応を開始させるという従来の方法を用いていました。アッセイ準備時間と細胞培養消耗品を節約しながらも、確実なシグナルを発生させるために、Calcium 6-QFオプションの使用に基づいたワークフローを開発。これにより、クエンチャーの干渉を受けずに細胞を懸濁状態に保つことができ、アッセイ量を調節して混乱を最小限に抑えながらも、良好なシグナルウィンドウを得ることができました（図6参照）。4パラメータカーブフィットを用いてアゴニストEC₅₀値を算出（図7）。

UTPとATPのEC₅₀の計算値を、FlexStation 3プレートリーダーおよびFLIPR Pentaシステムで得られた同等のデータと合わせて表2に示します。3つの装置で大きな違いは観察されなかったです。

表2. カルシウム6-QF色素負荷THP-1細胞から得られたアゴニストEC₅₀値。データはすべてμMで、n≧3の独立実験。

結論

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダー、SmartInject テクノロジー搭載SpectraMax インジェクターカートリッジ、およびFLIPR Calcium 6および6-QFアッセイキットを用いて、接着細胞株と浮遊細胞株の両方において、頑健で再現性の高いカイネティクスアッセイを開発できることを実証。

マスキング技術を用いたFLIPR Calcium 6試薬を用いた接着性1321N1細胞では、アゴニストとアンタゴニストの両方のデータが、FlexStation 3プレートリーダーやFLIPR Pentaシステムなどの中・高スループットシステムで得られたデータとほぼ一致。さらに、THP-1細胞については、細胞内Ca²⁺アッセイを開発する際に懸濁状態の細胞を使用できるように、FLIPR Calcium 6 Assayのクエンチフリー（QF）製剤を用いてiD3およびiD5プレートリーダーで新しいワークフローを開発することが可能であることを初めて示しました。

さらに、SpectraMax iD3 および iD5 プレートリーダーで得られたデータは、FlexStation 3 プレートリーダーおよび FLIPR Penta システムで得られたデータとよく相関しています。プレートリーダーは手頃な価格でアップグレード可能なシステムであり、研究者がすぐにELISAや細胞生存率アッセイを実施できます。インジェクターを追加するだけで、より高スループットのシステムで開発されたものに匹敵する、情報量の豊富な細胞ベースのキネティックアッセイを開発することができます。