Application Note 細菌増殖アッセイの高度なkinetic解析

はじめに

Michel Hoogenkamp｜研究技術者｜アムステルダム歯科学術センター（ACTA）
Cathleen Salomo｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

院内感染では、殺菌困難な細菌が問題となっています。これらの細菌を死滅させる化合物の同定は、多くの製薬会社が関心を寄せています。これらの化合物の有効性をスクリーニングするためのアッセイの開発と最適化は、多くの微生物学者が直面する課題です。

ここでは、SoftMax® Pro 7.0（またはそれ以上）のデータ収集・解析ソフトウェアを用いた細菌増殖アッセイのセットアップについてご説明します。細胞密度とGFPシグナルの両方を、Workflow Editorの取得機能を用いて時間経過にわたって記録。GFPシグナルを細胞密度に正規化したり、増殖速度やその他のkinetic関連情報を抽出するなど、ソフトウェアにおける様々なデータ形質転換ステップについてご説明します。

材料

• エンテロコッカス・フェカリス株OG1RF 下記が含まれます：

◦プラスミドpMV158-GFP（緑色蛍光タンパク質）

• 96ウェル ブラック・ウォールドμClearマイクロプレート（Greiner Bio-One）
• qPCRシール（Eurogentec）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）：

◦SoftMax Pro 7.0（またはそれ以上）ソフトウェア

方法

Workflow Editorを用いたデータ取得

オランダの歯科学術センター予防歯科学科（ACTA）で、SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して細菌増殖データを取得しました。ここでは、プラスミドpMV158-GFPを封じ込めたEnterococcus faecalis OG1RF株を様々な増殖条件で使用。GFP（緑色蛍光タンパク質）発現は異種発現であり、この菌株はHoogenkampらの発表に記載されており *1、GFPは染色が困難な種であるE. faecalisの生存率マーカーとして研究されました。PBS中のE.フェカリス150μlとバックグラウンド対照としてPBSを96ウェル ブラック・ウォールドμクリアプレートにプレーティング。蒸発を防ぐため、マイクロプレートをqPCRシールで覆いました。その後、マイクロプレートをSpectraMax i3xプレートリーダーにセットし、kinetic測定の間、37℃でインキュベート。

SoftMax Pro Workflow Editorを使用して、吸光度測定（PlateOD600）と蛍光測定（PlateGFPBottom）を含むkinetic測定サイクルを作成し、その間に5秒間プレートを直線的に振りました（図1）。吸光度を600 nmで測定し（OD₆₀₀）、細菌の増殖を測定。生存率の指標である GFP 発現は、励起波長 485 nm（バンド幅 9 nm）、発光波長 515 nm（バンド幅 15 nm）の下方測定を行う蛍光検出を用いてモニターしました。両方のデータトレース（吸光度と蛍光）は、2つの独立したプレートセクションで記録しました。kineticのサイクルは15分ごとに1回、合計18時間繰り返すように設定。オプションのソフトウェア機能により、ユーザーはkinetic測定を一時停止したり再開したりすることができ、実行中に試薬を追加することができます（この実験では使用しなかった）。得られたデュアル測定モードのkineticデータは、SoftMax Proソフトウェアを使用して解析しました。

図1. dual read mode kinetic readingのためのSoftMax Pro 7 Workflow Editor。ドラッグ＆ドロップ機能により簡単に設定でき、カスタマイズしたワークフローを迅速に設定できます。

削減設定ダイアログを使用したデータ解析オプション

データ解析の初期段階として、ユーザーはブランクを定義するかどうかを決定する必要があります。ブランクウェルの位置はテンプレートエディターを使用して設定し、グループブランクまたはプレートブランクを選択できます。プレートブランクは、各タイムポイントでプレート内の全サンプルウェルのローデータから差し引かれるのに対し、グループブランクは関連するサンプルウェルのみから差し引かれます。この実験セットアップでは、バクテリアまたは他の生物種による汚染の可能性をコントロールするために、バッファーのバックグラウンドのトレースが捕捉されました。バッファーはOD₆₀₀またはGFP測定のいずれにも干渉しなかったため、減算は必要なかったです。培地やバッファー成分がOD₆₀₀や蛍光を妨害する場合は、吸光度チャンネルまたは蛍光チャンネルのどちらかの真のシグナル値を取得するために、ブランクの減算が推奨されます。また、これにより測定値の比較可能性が高まります。

高度な kinetic data解析は、reduction設定ダイアログを通じて提供されます。図2はバクテリア増殖実験のreduction設定を示しています。メニューは、ローデータとデータ削減ステップの2つのセクションに分かれています。

図2. Reduction Settingsメニューのデータ解析オプション。この例では、プレートセクション'PlateOD600nm'の光学密度データの対数形質転換と、それに続く曲線の最 急峻部を検索するための5つのVmaxポイントによるVmaxレート値への還元を示しています。

ローデータのステップには、すべてのkinetic tracesの最初のデータポイントをゼロに設定するオプションが含まれています。さらに、kinetic reductionの前または後にブランク計算を含めることができます。「before reduction」を選択すると、平均化されたブランクウェルのカイネティックデータトレースが、すべてのローデータセットから各タイムポイントで個別に差し引かれます。「after reduction」を選択すると、サンプルウェルのデータから、Vmaxレートなどの縮小されたブランクウェルのデータの平均が差し引かれます。

Data reductionステップとデータ出力タイプには、以下のオプションがあります（図2）：

• Limits： 必要に応じて、データ削減分析に含まれるkinetic dataの範囲を制限します。リミットはシグナル軸（OD、RLU、RFU）および／または時間軸（秒）に設定できます。同じ分析範囲がすべてのウェルに適用されます（図2、緑枠）。
• Wavelength Options（波長オプション）： 選択した範囲内でシグナル軸を形質転換します。デフォルトでは、最初に測定された波長（Lm1）が選択されます。シグナル軸の形質転換の例を2つ示します：
  
  • Normalization： 2つの波長データトレースが同じプレートセクション内でキャプチャされた場合、ドロップダウンメニューには、比率（波長1/波長2 = !Lm1/!Lm2）のような事前設定された選択項目が表示されます。このアプリケーションノートに記載されているデータ例では、データトレースは2つの別々のプレートセクションで取得されているため、レシオメトリックシグナルの正規化にはカスタム式が必要でした。GFPシグナルをバクテリアの細胞密度に正規化するために、以下の式を入力：
    KinPlot@PlateGFPBottom/KinPlot@PlateOD600。これを2つのプレートセクションのどちらかに適用。!KinPlot式は、記号'@'と対応するプレートセクション名で参照される指定されたプレートセクションのkinetic data setを抽出。ローデータ・トレースと形質転換（正規化）データ・トレースの比較図を図3に示します。

図3. OD₆₀₀における細胞密度に正規化したGFPシグナル。

• • Logarithmic Scaling： OD₆₀₀の指数関数的成長段階を線形化する
  • データトレースの指数関数的成長段階を直線化するために、OD₆₀₀で対数変換を適用。
  • プレートセクションで対数変換を適用。図2（青枠）に示すように、Ln(!Lm1)と入力して自然対数を使用するカスタム式を追加。ローデータと対数スケーリングデータの比較を図4に示します。

• 図4. OD₆₀₀データに対数スケーリングを適用したローデータと縮小データのビュー。各実験条件の例としてウェルA1～A5を使用。上：OD₆₀₀ kinetic data tracesのローデータ（青線）。下：対数スケーリングで形質転換したローデータ（黒線）と、Vmaxデータ削減を適用して指数関数相の成長速度を決定したもの（オレンジ線）。対応する削減設定を図2に示します。

• kinetic reduction： このステップでは、各データトレースをVmaxレートやOnset Timeのような削減された単一の値にさらに形質転換します。利用可能な事前設定済みkinetic reductionパラメータの全リストと詳細は表1に記載されています。上記の対数スケーリングの例は、kinetic reductionを説明するために使用されています：

表 1. 事前に設定されたkinetic reductionオプション。

• OD ₆₀₀データトレースの対数変換の後続ステップとして、図2（赤枠）に示すようにVmaxレートを抽出することにより、最大成長率を取得することができます。Vmax率は、勾配を決定するために使用される線分の最大サイズを定義するVmaxポイントをユーザーが調整できるという利点を提供します。Vmaxはカイネティック縮小プロットではオレンジ色の線で表示されます（図4、縮小データビュー）。プレートセクションビューで全ウェルのカイネティック縮小グラフを最適に比較するには、「Display（表示）」から「Reduced Data（縮小データ）」を選択し、「Plot（プレーティング）」オプションを選択します。
  異なる増殖条件を数値として表形式で比較するには、テンプレートエディターツールを使用すると、ウェルをサンプルグループに割り当て、図5（上）に示すように、縮小データ（Vmax rate）を表形式で表示できます。その後の計算ステップにより、増殖率（k）と倍加時間（g）の両方が得られます。データをより見やすくするために、結果を棒グラフで表示することもできます（図5下）。

図 5. 結果表示オプション。プレート断面の縮小データ表示と、E. faecalisの各実験条件（カラム1～5、n=8）の結果が、棒グラフと同様に結果表にまとめられています。Vmax率は、増殖速度（k=Vmax*3600）と倍加時間（g=ln2/k）の両方を取得するために使用されました。

結論

SoftMax Pro 7 ソフトウェアのWorkflow Editorは、SpectraMax i3xプレートリーダーを含むモレキュラーデバイス マルチモードマイクロプレートリーダーとともに、光学密度および蛍光タンパク質発現と同時にkinetic growth dataを記録する柔軟性を提供します。解析はSoftMax Proソフトウェアに組み込まれており、データの正規化や対数スケーリング調整など、細菌増殖データのさまざまなデータ解析オプションや形質転換を提供します。Vmax速度やオンセット時間など、さまざまなkinetic data reductionパラメーターがソフトウェアにあらかじめ設定されています。希望するデータ出力パラメータは、表やプレート形式で簡単に統合でき、棒グラフや散布図としてグラフ化できるので、さまざまな実験条件の評価をサポートします。

参考文献

1. Hoogenkamp MA, Crielaard W, Krom BP. Enterococcus faecalisにおける生存率マーカーとしての緑色蛍光タンパク質の用途と限界： 観察的調査。J. Microbiol. Methods (2015) Aug;115:57-63.