Application Note Far-red蛍光で細胞内活性酸素種を測定

イントロダクション

Hoang Ha｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

活性酸素種（ROS）は、好気性細胞代謝により生成される酸素を含む化学的に反応性の分子です。これらの化学種は、細胞シグナル伝達、恒常性、免疫防御などの細胞プロセスに関与します。しかし、環境ストレス下では細胞内ROSレベルが急激に増加し、脂質、タンパク質、核酸に酸化的損傷を引き起こします *1。この変化は、男性不妊、発がん、その他多くの生理学的状態など、さまざまな病理学的事象に関連しています *2。

細胞内ROSレベルの測定には蛍光プローブが一般的に使用され、緑色蛍光プローブが最も広く利用されています。しかし、緑色蛍光領域での検出やイメージングは、細胞の自家蛍光の影響を受ける可能性があります *3。代替として、Far-red蛍光や近赤外（NIR）蛍光色素を使用することで、細胞自家蛍光による干渉を回避しながらROSレベルを測定できます。

SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーの特許取得済み超冷却PMTと4モノクロメータ光学経路設計は、シグナルのバックグラウンドや迷光を低減します。これにより、Far-red蛍光アッセイにおいて広いダイナミックレンジと高感度を提供します。

ここでは、SpectraMax iD5プレートリーダーを用いて、2種類の蛍光測定アッセイキットで細胞内ROSレベルを測定する方法を紹介します。Spectral Optimization Wizardを使用してFar-redアッセイの励起波長と蛍光波長の組み合わせを最適化し、最後に緑色蛍光アッセイとFar-red蛍光アッセイの性能を比較しました。

材料

• セルメーター™ 蛍光細胞内総ROS活性アッセイキット*深赤色蛍光* (AAT Bioquest)
• セルメーター™ 蛍光細胞内総 ROS 活性測定キット * 緑色蛍光* (AAT Bioquest)
• HEK293細胞 (AATC)
• メナジオン (Sigma)
• 96ウェル組織培養処理黒壁透明底96ウェルプレート (Greiner)
• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

HEK293細胞を複数の96ウェル細胞培養処理済みマイクロプレートに1ウェルあたり10,000細胞で播種し、37°Cインキュベーターで24時間回復させました。その後、メナジオンを25 μMから開始する2倍希釈系列で1時間処理しました。処理後、Cell Meter Deep Red ROS検出試薬またはCell Meter Green Fluorescence ROS検出試薬を細胞に添加し、プレートを37°Cで30分間インキュベートしました。

Cell Meter Deep Red ROSアッセイの推奨波長ペア（658/675）は、励起波長と蛍光波長の近接性によりSpectraMax iD5リーダーでは非互換でした。本実験では、励起と蛍光モノクロメータ帯域幅の間に十分な距離を確保しつつ、十分な蛍光シグナルを得るために625/700の波長ペアを推定しました（図1）。

図1. Far-red蛍光スペクトル Cell Meter Deep Red ROSアッセイの励起および蛍光スペクトルを示します。赤の点線は励起スペクトル（ピーク650 nm）、赤の実線は蛍光スペクトル（ピーク675 nm）を表します。灰色のバーは選択された非最適化波長ペアと、それに対応するモノクロメータ帯域幅（励起15 nm、蛍光25 nm）を示します。

SoftMax® ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用してFar-redアッセイの最適な励起・蛍光波長ペアを自動計算しました。また、「Read Height Optimization」設定を使用してアッセイの最適なリード高さを決定しました。実験で使用した波長とPMTゲインは表1に示します。データとグラフはSoftMax Proソフトウェアで生成しました。

表1. アッセイにおける波長とPMT設定

結果

メナジオンはミトコンドリア電子伝達系のさまざまな部分を阻害することで細胞内ROSの蓄積を引き起こすため⁴、メナジオン濃度の増加に伴い細胞内ROSレベルの上昇が予想されました。緑色蛍光アッセイとFar-red蛍光アッセイの両方で、メナジオンの用量反応曲線が得られ、EC₅₀値は類似していました（図2および図3）。Far-redアッセイにおけるSpectral Optimization Wizardの波長組み合わせは、最良のZ´因子を提供しました（表2）。

図2. 緑色蛍光による細胞内ROS測定 メナジオン処理したHEK293細胞をCell Meter Green Fluorescence Intracellular ROSアッセイで評価し、SoftMax Proソフトウェアで4パラメータ用量反応曲線を生成しました。データからEC₅₀は1.86 μMと算出されました。

図3. Far-red蛍光による細胞内ROS測定 Spectral Optimization Wizardで決定された波長ペア（水色）は、ユーザー推定波長ペアと比較してより大きなアッセイウィンドウを生成しました。EC₅₀値は、最適化波長ペアで2.10 μM、推定波長ペアで2.21 μMでした。

表2. Cell Meter Far-redアッセイの用量反応およびZ因子 各アッセイから算出されたEC₅₀値は類似しており、いずれもZ因子が0.5を大きく上回り、堅牢なアッセイであることを示しました。

結論

SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax® Proソフトウェアの組み合わせは、細胞内ROSレベルを蛍光測定するための優れたツールです。SoftMax ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardとリード高さ最適化機能は、最良の結果を得るためにアッセイ条件を自動的に最適化します。SpectraMax iD5リーダーは両方のアッセイを効果的に検出できましたが、励起・蛍光波長を最適化したFar-redアッセイは、緑色蛍光アッセイよりもわずかに良好なZ´因子を示しました。

参考文献

1. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. "Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways. "Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2): 345-50
2. Ogawa K, Suzuki K, Okutsu M, Yamazaki K, Shinkai S. The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade inflammation in the elderly. Immunity & Ageing: I & A. 2008; 5:13. doi: 10.1186/1742-4933-5-13.
3. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new fluorescent proteins brighten the infrared scene. "Nature Methods 8.9 (2011): 726.
4. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinskiĭ. "Interaction of menadione and duroquinone with Q-cycle during DTdiaphorase function. "Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991): 1779-1786.