アプリケーションノート

SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーによる SimpleStep ELISA キットを用いた インターロイキン-8 濃度の定量

利点

  • Abcam 社のSimpleStep ELISA キットを用いてELISA にかかる実験時間を260 分から90 分に短縮
  • SpectraMax ABS PlusマイクロプレートリーダーによりELISA プレート1 枚の測定をわずか5秒で完了
  • SoftMax Pro ソフトウェアによりサンプル濃度を自動的に算出し結果をプロット

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はじめに

THP-1(急性単球性白血病患者由来のヒト単球性細胞株)は、しばしばin vitro でのマクロファージの機能研究に用いられています。THP-1 細胞は、通常懸濁状態で培養されますが、ホルボール12- ミリスタート13- アセタート(phorbol 12-myristate 13-acetate、PMA)で処理されると、マクロファージに分化し接着性になります。それらはまた、インターロイ-8(interleukin-8、IL-8)を含むサイトカインの放出を始めます。IL-8 は多様な細胞型により分泌され、急性炎症反応の調節の役割を果たします。

酵素結合免疫吸着法(ELISA)は、一般的に96 ウェルマイクロプレートを用いてIL-8 のような検体を定量するのに用いられます。典型的なELISA では実験に4 時間以上かかることもありますが、Abcam 社のimpleStepELISA® キットではちょうど90 分、費やす時間をほぼ2/3 に短縮してELISA を実施可能です(図1)。このアプリケーションノートでは、ヒトのIL-8 SimpleStep ELISA の実施、およびSoftMax® Pro ソフトウェアにプリセットされた便利なプロトコルを利用したSpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーによる測定について記述します。

材料

  • Human IL-8 SimpleStep ELISA kit(Abcam cat. #ab214030)
  • THP-1ヒト末梢血単核球細胞株(ATCC #TIB-202)
  • THP-1培養培地
  • RPMI-1640培地(ATCC #30-2001)
  • Benchmark™ ウシ胎児血清(Gemini #100-106)
  • 2-メルカプトエタノール(Sigma #M6250-100mL)
  • ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)(ThermoFisher #15140122)
  • SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー(Molecular Devices #ABS Plus)

方法

THP-1 細胞の調製

96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに未分化のTHP-1 懸濁細胞を20,000 細胞ずつ播種しました。その後、培養培地で希釈した2.5ng/μL PMA またはDMSO(陰性対照)を添加し、THP-1 細胞を処理しました。細胞を37℃で48 時間インキュベートした後、細胞培養上清を集め、ELISA を実施するまで–80℃で保存しました。

ELISA

ELISA を実施する当日、サンプルの培養上清を解凍し、夾雑物を除くためにマイクロ遠心分離機で2,000 × g で10 分間遠心しました。
続いて、キットに付属するSample Diluentを用いて1:5、1:10、1:50 に希釈しました。Human IL-8 SimpleStep ELISA kit の試薬と標準試料は、キットのプロトコル小冊子に従って調製しました。サンプルと標準試料をキットに付属するマイクロプレートに分注し、次に抗体カクテルを各ウェルに添加、さらにプレートにシールをして、プレートシェーカーを用いて室温で1 時間インキュベートしました。
その後、ウェルをWash Buffer PT で3 回洗浄しました。各ウェルにTMB Substrate を加え、暗所のプレートシェーカー上で15 分間インキュベートしました。各ウェルにStop Solution を添加し、SoftMax Pro ソフトウェ
アにプリセットされたプロトコルを使用してSpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーを用いて450 nm における吸光度(OD)を測定しました(ワークフローは図1 を参照)。

図1 Abcam 社のSipleStep ELISA と従来のELISA とのワークフローの比較
Abcam 社のSimpleStepELISA はその合理化されたプロトコルで90 分以内に結果を出すことができます。従来のELISA とは異なり、SipleStep ELISA は1 回のインキュベーションと1 回の洗浄ステップのみを必要とし、これによりアッセイにかかる時間をほぼ2/3 に短縮できます。

結果

SoftMax Pro ソフトウェアの「HRP & TMB」プロトコルを用いたところ、直線回帰でr2 =1.000 のIL-8 検量線を描くことができました(図2)。この検量線を用いて、DMSO で処理した陰性対照細胞およびPMA 処理した細胞に由来するサンプルのIL-8 濃度が求められました。希釈が不充分なサンプルは、プロトコルにあらかじめ設定されている結果のグループ表において、「検量線範囲外、‘R’」としてフラグが立てられました(図3)。PMA処理した細胞のIL-8 濃度は、DMSO 処理陰性対照細胞(63 pg/mL)よりも55 倍高い3400 pg/mL と算出されました(図4)。

図2 ELISA の検量線
IL-8 標準試料をSample Diluent で希釈し、Human IL-8 SimpleStep ELISA kit を用いてアッセイしました。SoftMax Pro ソフトウェアで標準試料に線形回帰を適用して得られた検量線は、優れた直線性(r2 = 1.000)を示しました。

図3 計算されたサンプル濃度を表示するグループ表
SoftMax Pro ソフトウェアのプリセットされたプロトコルにより、PMA 処理した細胞のIL-8 濃度が検量線から自動的に算出されグループ表に表示されました。‘R’ 列に‘R’と表示されたサンプルは、標準試料の濃度範囲外の領域の検量線から濃度が求められたことを意味しています。今回の場合、サンプルの希釈を行う必要があることが示唆されます。

図4 未分化および分化したTHP-1 細胞におけるIL-8 濃度
未分化(DMSO 陰性対照)および分化(2.5 ng/μL PMA 処理)したTHP-1 細胞でIL-8 の濃度を測定した。未分化なTHP-1 細胞は62 pg/mL、分化したTHP-1 細胞は3400 pg/mL のIL-8 を産生していると求められ、PMA 処理により55 倍の増加が観察された。

結論

SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーは、Abcam 社のHuman IL-8 SimpleStep ELISA kit とともに迅速かつ高感度なIL-8 検出をもたらします。SimpleStep ELISAの特許取得済み抗体バインディングテクノロジーは、従来のELISA 実験に要する時間のおよそ1/3 に相当するわずか90 分で、THP-1 細胞培養上清のIL-8 定量を可能にします。

プレートリーダーの8 チャンネル検出器は、ELISA の96 ウェルマイクロプレート1 枚をわずか5 秒で測定します。SoftMax Pro ソフトウェアにプリセットされたプロトコルは、検量線の自動作成、サンプル濃度の自動算出を行います。また、陰性対照サンプルと処理群の結果を棒グラフで表示できます。これらによって、発表に使用できる高品質な結果を得るための時間を大幅に短縮できます。

SimpleStep ELISA® is a registered trademark ofAbcam plc.
SimpleStep ELISA® は、Abcam 社の登録商標です。

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