はじめに

BRET（生物発光共鳴エネルギー移動）は、生物発光するドナーと蛍光を発するアクセプターとの相互作用を利用したタンパク質- タンパク質間またはタンパク質- リガンド間の相互作用を測定するための技術です。ドナーとアクセプターが互いに10 nm より近接したとき、ドナーはアクセプターを励起し、次いでアクセプターから蛍光が発せられます。興味のあるタンパク質をドナーにより、その結合のパートナーをアクセプターによりそれぞれタグ付けすると、ドナーおよびアクセプターから発せられた光をマイクロプレートリーダーで検出することにより、タンパク質間相互作用を測定できます。

Promega 社のNanoBRET™ テクノロジーは、より明るい発光ドナー（NanoLuc ルシフェラーゼ）、最適化されたエネルギーアクセプター（HaloTag®-NCT）、そしてドナーとアクセプターの間のより広い波長の分離を上手く取り入れることにより、BRET1 やBRET2 といった従来のBRET 法よりも改良された技術です（図1）。これらの改善は、シグナルの増加とより低いバックグラウンド、そして感度 の向上をもたらし、生細胞内におけるタンパク質間相互作用の検出を可能にします¹。

NanoBRET シグナルの検出と得られたデータの解析には、高感度な測定装置と高度なソフトウェアが必要です。SoftMax® Proソフトウェアを搭載したSpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーにより、最適化されたフィルターセットを使用してNanoBRETのデータを取得し、カーブフィッティングを含む解析を迅速に行えます。このアプリケーションノートでは、p53 およびMDM2という相互作用するタンパク質から成るNanoBRET™ PPI Control Pair を用いた、SpectraMax iD5 マイクロプレートリーダーの評価について説明します。

p53 経路の活性化因子であるNutlin-3 を用いてp53 とMDM2 の相互作用を濃度依存的に阻害し、その結果をSoftMax Pro ソフトウェアを用いて解析し、グラフを作成しました。

図1 NanoBRET アッセイ
NanoLuc-Protein A 融合タンパク質（エネルギー供与体、ドナー）が蛍光標識HaloTag-Protein B 融合タンパク質（エネルギー受容体、アクセプター）と相互作用すると、ドナーとアクセプターが接近し、エネルギーが転移します。

材料

• NanoBRET PPI Control Pair（p53、MDM2）、Promega、Cat# N1641
• NanoBRET Nano-Glo® Detection System、Promega、Cat# N1661
• ViaFect™ Transfection Reagent、Promega、Cat# E4981
• Nutlin-3、Millipore-Sigma、Cat#6287
• Opti-MEM™ Reduced Serum Medium,No phenol red、ThermoFisher、Cat#11058021
• HEK-293細胞、ATCC、Cat# CRL-1573
• Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）、Corning、Cat#10-010-CV
• BenchMark™ Fetal Bovine Serum、Gemini Bio-Products、Cat#100-106
• ペニシリン-ストレプトマイシン（10000 U/mL）、ThermoFisher、 Cat#15140122
• 6ウェルクリアマイクロプレート、VWR、Cat#1006-892
• 96ウェル白色平底ポリスチレンマイクロプレート、Corning、Cat#3917
• SpectraMax iD5マルチモードマイクロプレートリーダー、Molecular Devices、Cat#iD5-STD

 

手法

HEK-293 細胞を細胞培養培地（EMEM +10% ウシ胎児血清+ 1% ペニシリン/ ストレプトマイシン）中に400,000 cells/mL で懸濁し、6 ウェルプレートにウェル当たり2 mL（800,000 細胞）となるように播種しました。細胞を37℃、5% CO2 環境下で4 ～ 6 時間培養し、ウェル底に付着させました。次に、2 μg のp53-HaloTag 融合ベクターDNA および0.2 μgのNanoLuc-MDM2融合ベクターDNA をViaFect Transfection Reagent：DNA 比が3：1 となるように、最終容量100μL のOpti-MEM Reduced Serum Mediumを用いて調製し、トランスフェクションを行った。さらに、細胞を37℃、5% CO2 環境下で20 ～ 24 時間インキュベートしました。

HEK-293 細胞を1,000 rpm で5 分間遠心し回収しました。Opti-MEM + 4% FBS を用いて細胞密度が2.2 × 105 cells/mL となるように調製し、2 本の15 mL コニカルチューブに分注しました。一方のチューブを0.1 μMHaloTag 618 Ligand で処理し、他方をリガンドなしとして処理しました。細胞を96 ウェル白色マイクロプレートに2 × 104 cells/wellとなるように播種し、直ちに、1：3 の段階希釈したNutlin-3（各濃度n = 4）あるいは0.5%DMSO のいずれかで処理しました。細胞を37℃、5% CO2 環境下で一晩インキュベート
しました。

NanoBRET Nano-Glo 基質の5 倍溶液をOpti-MEM + 4% FBS を用いて調製し、それを25 μL ずつ各ウェルに添加しました。ドナーの発光（447 nm）とアクセプターの発光（610nm）を、SpectraMax iD5 マイクロプレートリーダーを用いて表1 に示す設定で測定しました。SoftMax Pro ソフトウェアにおいて、アクセプターシグナルをドナーシグナルで割ることによってNanoBRET 比を計算し、その比に1000 を乗じて、整数ミリBRET 単位（mBU値）を算出しました。mBU 値は、リガンドを含有しないサンプルのmBU 値平均値を差し引くことによってバックグラウンドを補正しました。Nutlin-3 処理した細胞の結果は、SoftMax Pro ソフトウェア（Ver. 7.0.3 以降）を用いて解析し、4-parameter カーブフィッティングによりプロットしました。また、アッセイ系の精度を評価するために、Nutlin-3 の各濃度でZ’ Factor を求めました。

表1 SpectraMax iD5 マイクロプレートリーダー用のNanoBRET の検出設定

結果

NanoBRET 比（mBU） に対するNutlin-3濃度の関係をSoftMax Pro ソフトウェアを用いて4-parameter カーブフィッティングによりプロットしました（図2）。Nutlin-3 のIC50値は1.2 μMと求められ、これはNanoBRETPPI Control Pair についてPromega社によって示された結果と一致しました²。

図2 に示した曲線を形成するNutlin-3 のすべての濃度において、Z’ Factor は0.7 以上と計算され、また、0.07 μM 以下の濃度では、0.9 と計算されました。これらの値は、このNanoBRET アッセイがロバストであることを意味しています。

図2 Nutlin-3 によるp53とMDM2の相互作用の阻害
SoftMax Proソフトウェアの4パラメーターカーブフィットによって求められたIC50 は1.2 μM（n = 4）であった。

参考資料

1. Machleidt T, Woodroofe CC, Schwinn MK,Mendez J, Robers MB, Zimmerman K,Otto P, Daniels DL, Kirkland TA, andWood KV. NanoBRET̶A Novel BRETPlatform for the Analysis of Protein-Protein Interactions. ACS Chem. Biol.
   2015, 10, 1797-1804.
2. Technical Manual: NanoBRET Protein:Protein Interaction System. PromegaCorporation.