ImageXpress Picoを用いたミトコンドリア完全性とミトコンドリア膜電位の評価

アプリケーションノート

ImageXpress Picoを用いたミトコンドリア完全性とミトコンドリア膜電位の評価

利点

  • 化合物処理に対するミトコンドリアの完全性および膜電位の反応を評価
  • ミトコンドリア毒性を評価するための多角的な解析結果をすぐに表示
  • CellReporterXpress画像取得・解析ソフトウェアのプリセットプロトコルによりアッセイ結果を効率よく表示

このページは、自動翻訳ツールを用いて制作されているため、正確でない表現が含まれている可能性があります。原文は下記よりダウンロードできます。

PDFダウンロード

ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステムについて問い合わせる

はじめに

ミトコンドリア機能は細胞健全性の重要な指標ですが、これはミトコンドリア膜電位(MMP)の変化を観察することにより評価が可能です1,2。ミトコンドリアの脱分極は低酸素障害または酸化ストレスを示す早期シグナルですが、MMPの評価ツールとして、陽イオン蛍光色素が多く用いられています。このアプリケーションノートでは、酸化的リン酸化の阻害剤として知られる2つの化合物、アンチマイシンAおよびカルボニルシアニド-m-クロフェニルヒドラゾン(CCCP)で、細胞を短時間(60分間)処理し、続いてMitoTracker Orange染色および核染色を行いました。このアッセイ法を用いて化合物のMMPに及ぼす即時的影響の検討が可能です。

方法

U20S細胞(ATCC)を、6,500 cells/wellで384ウェルプレート(Greiner、クリアボトム黒色プレート)に播種し、翌日、各濃度のアンチマイシンAおよびCCCP(Sigma)で60分間処理しました。アンチマイシンAおよびCCCPは、それぞれ最高濃度100 μM およ50 μM から4倍の段階希釈(1:3)を行い、各濃度3ウェルずつで処理を行いました。化合物による処理開始30分後に、MitoTracker OrangeおよびHoechst 33342(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)をそれぞれ最終濃度が0.1 μM および6 μM になるようPBS中に混合した溶液を用いて、細胞を30分間染色しました(37℃、5%CO2)。画像の取得は生細胞を用いても、パラホルムアルデヒド固定細胞を用いても可能です。細胞の固定は、4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて室温で30分間行いました。PBSバッファーで2回洗浄した後、ImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムを用いて細胞の20倍画像を取得しました。DAPIおよびTRITCチャネル(それぞれ露光時間20 msおよび300 ms)を用いて、1ウェル当たり1画像を取得しました。

ミトコンドリアの完全性および膜電位のマルチパラメーター解析

図1に、CCCP(酸化的リン酸化阻害剤)処理細胞と対照細胞の画像を示します。正常なミトコンドリア(橙色)の数に劇的な差が認められました。CellReporterXpress™画像解析ソフトウェアのミトコンドリア解析プロトコルを用いて、ミトコンドリアの損傷に関する評価を行いました。解析では、核染色に基づいて特定された各細胞中の粒子(ミトコンドリア)を検出します(図1)。これにより粒子の総数、粒子の総面積、1細胞当たりの粒子数、並びに粒子の平均蛍光強度および積分蛍光強度などの、複数のパラメーターに関する特性解析が可能になります。図2および表1に、解析結果の濃度反応曲線とEC50値を示します。

図1. 自動イメージングによるミトコンドリアの完全性および膜電位の評価
CCCPで60分間処理後のU2OS細胞と対照細胞の画像(20倍)およびCellReporterXpressソフトウェアを用いた画像解析マスク。
左列:MitoTracker Orange(橙色)染色およびヘキスト核染色(青色)後のCCCP(1 μM)処理細胞と対照細胞の画像。
右列:細胞核(緑色)およびミトコンドリア粒子(白色)を示す画像解析マスク。酸化的リン酸化阻害剤CCCPによる処理の結果、膜電位の消失
が認められました。


図2. CCCP(赤色)およびアンチマイシンA(緑色)に対する各解析項目の濃度反応曲線
CellReporterXpressソフトウェアのミトコンドリア解析プロトコルを用いて、これら2つの化合物がミトコンドリアの完全性および膜電位に及ぼす影響に関する、解析・定量化を行いました。各解析項目のEC50値を表1に示します。

化合物 解析項目 EC50±標準偏差
アンチマイシンA 粒子総数 7.649 ± 3.286
1細胞あたりの平均粒子数 4.692 ± 2.131
粒子の総面積 3.359 ± 1.426
平均積分蛍光強度 0.906 ± 0.227
CCCP 粒子総数 0.349 ± 0.035
1細胞あたりの平均粒子数 0.334 ± 0.028
粒子の総面積 0.233 ± 0.019
平均積分蛍光強度 0.200 ± 0.017

表1. 図2に示した各解析項目のEC50
ミトコンドリア解析プロトコルから、アンチマイシンAおよびCCCPがミトコンドリア完全性およびMMPに及ぼす影響を表す複数の解析項目が選択できます。

結論

ミトコンドリアの機能障害は、神経変性疾患や心血管疾患など様々な疾患の原因、並びに、一部の医薬品や様々な環境物質への曝露による毒性作用に関係しています。ImageXpress PicoシステムおよびCellReporterXpressソフトウェアを用いると、数多くのセルベースアッセイにおけるミトコンドリア完全性およびミトコンドリア膜電位を効率よく評価できることが明らかになりました。

このページは、自動翻訳ツールを用いて制作されているため、正確でない表現が含まれている可能性があります。原文は下記よりダウンロードできます。

PDFダウンロード

ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステムについて問い合わせる

参考文献

  1. Sakamuru, S., Attene-Ramos, M. S., & Xia, M.(2016). Mitochondrial Membrane PotentialAssay. Methods in Molecular Biology (Clifton,N.J.), 1473, 17–22. http://doi.org/10.1007/978-1-4939-6346-1_2
  2. Attene-Ramos MS1, Huang R, Michael S,Witt KL, Richard A, Tice RR, Simeonov A,Austin CP, Xia M. (2015). Profiling of the Tox21chemical collection for mitochondrial functionto identify compounds that acutely decreasemitochondrial membrane potential. EnvironHealth Perspect. 123(1):49-56.