Kinetic Characterization

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速度論的特性解析


生体分子の速度論

抗体および他のタンパク質の速度論的分析は、創薬開発や生産におけるクローン選択および特性解析にとって重要です。 Octet®ファミリーは、検出面を直接サンプルに当てることでカイネティクス定数を正確に測定しマイクロ流路を必要としません。ラベルフリーのリアルタイム分析を利用する特徴的なアプローチは、研究室のワークフローを合理化し、アッセイ開発を加速します。機器のメンテナンスを最小限に抑えながら、疎精製サンプルを直接測定できます。


Octetシステムでのカイネティクスの特徴

  • カイネティクス分析:簡単、精確にka, kd, and KDが決定できる
  • カイネティクススクリーニング:96、384プレートの全カイネティクス分析を実施
  • スループットの増加:最大96サンプルの同時読み取り
  • クルードサンプルの直接分析:サンプルの精製、前処理不要

アフィニティ測定— ka, kd, KD

ELISAにより得られたIC 50値からのカイネティクス情報の概算とは異なり、リアルタイムのカイネティクス測定は直接的かつより現実的な分子間相互作用の描写を提供します。 Octetファミリーの各機器は、完全親和性を測定するための高性能のラベルフリーシステムであり、ユーザーがka、kd、KDなどの速度定数を簡単かつ正確に求めることを可能にします。以下の測定は、streptavidinバイオセンサーを用いた完全な速度論的キャラクタリゼーションを示しています。抗原の滴定系列を固定化抗体に対して測定します。データセットをグローバルフィッティングで分析し、それによってka、kd、KDを計算します。



カイネティックスクリーニングとクローンセレクション

大規模な培養プールから最良のクローンの選択を試みている研究者は、Octetが持つ処理能力とクルードなサンプルへの適合性により大きなメリットを享受できます。今後発展する創薬の新時代では、テストすべきサンプルやクローンの数は増え続け、それらを効果的にスクリーニングすることがより重要になります。


アフィニティスクリーニング

受容体 – リガンド相互作用の親和性スクリーニングにおいて、溶解物標的をOctetシステムを用いて一連のアミン結合受容体に対してアッセイした。精製受容体をアミン反応性センサー上に固定化し、12個のリガンドに対して二重にアッセイした。図2の受容体 – リガンドスクリーニングは、12個全てのリガンドについての複製速度論値間の良好な再現性を示す。会合および解離定数の親和性等温線プロットは、等しい親和性(K D)を有するが異なる速度論的性質を有する相互作用をさらに区別するために使用されます。



Off-rateスクリーニング

Octetプラットフォーム上でStreptavidinバイオセンサーを使用して、ビオチン化抗原をバイオセンサー表面にオフラインで固定化した。 22クローンを結合およびその後の解離速度分析のために抗原に対してスクリーニングした。抗原を500秒間固定化し、続いて300秒間の解離速度を1回の実行でアッセイした。図3は、サンプリングされた3組の8つのセンサ(N = 22)についての実際のリアルタイムのカイネティック結合チャートを示す。 Octetシステムソフトウェアは、オフレート(Kd)を計算してグラフ化します。クローンのランク順を迅速に識別できるようにします。



リアルタイムバインチャート



Matched off-rate チャート


エピトープバインディング

複数の候補が標的に対して類似の親和性を有する場合、標的分子上の同じまたは異なるエピトープに対するそれらの優先性の決定はそれらの評価における重要な要素となります。同じエピトープを優先して候補をグループ(ビン)に分けることで、研究者らはクローンの特異性とその標的活性をブロックする能力をさらに特徴付けることができ、候補の有効性と薬物動態に広範な影響を及ぼす可能性があります。



図4:5時間での192個の抗体のバインニング。 Abdicheら。 Rinat-Pfizerハイスループットバインニング実験において、抗原はバイオセンサー上に捕捉され、続いて第一抗体を飽和状態に結合させる。次に競合抗体の結合を結合対に対して測定する。競合抗体からの陽性結合シグナルは競合の欠如を示します。すなわち第一抗体と競合抗体は抗原上の異なるエピトープに結合します。


アイソタイプ

バックグラウンドタンパク質の存在下で異なる抗体アイソタイプを検出することは、Octetシステムを用いて迅速かつ容易です。抗種抗体で固定化されたバイオセンサーは、ハイブリドーマ上清などの粗混合物から特定の抗体を捕捉します。一連のアイソタイプ特異的抗体への曝露は、粗混合物から抗体のアイソタイプを迅速に同定するためのサンドイッチフォーマットを提供します。



図5:ビオチン化抗マウスFc抗体をStreptavidinバイオセンサーに固定化した。次に、バイオセンサーを用いて、高タンパク質バックグラウンド(> 1mg / mL)を有する試料からアイソタイプ決定されるmIgG(10μg / mL)を結合した。緩衝液中で短時間洗浄した後、説明文に記載されているようにバイオセンサーを一連のアイソタイプ特異的抗体に曝露した。同時に最大8つのサンプルを処理するOctetシステムの能力を利用することにより、アイソタイプ特異的抗体のパネルを用いて、約15分でmIgGのアイソタイプを検出した。図をクリックすると大きな画像が見られます。


バインディングペアの選択

Octetシステムを使用した潜在的結合対のスクリーニングは、従来の方法を使用した場合に必要な分析時間に比べ大幅に短縮します。最適な結合ペアの選択により、ELISAなどの新しい結合アッセイの作成に必要な時間を大幅に短縮できます。単一のリガンドを8つのバイオセンサーに固定化することによって、96ウェルサンプルプレートにロードされた任意の検体の結合を迅速に検出することができます。アッセイが完了したら、結果の定性的評価はどの分析物が固定化リガンドに最もよく結合したかを同定する事が出来ます。



図6は、抗体対スクリーニングのリアルタイム結合図を示します。二対は、さらなるアッセイ開発に適していると直ちに決定することができます。検出抗体Ab5を有するAb1捕捉抗体は、分析物に対して良好な結合を示します。 Ab1 / Ab5間の相互作用もいくらかの解離を示し、これは弱い親和性を示します。 Ab4検出抗体を有するAb2捕捉抗体は、良好な結合と強い親和性の両方を示します。